论文摘要
本研究以宣木瓜不同部位的组织作为实验材料，对其进行组织和细胞培养，目的是诱导出宣木瓜生长旺盛、结构疏松的愈伤组织，从而建立宣木瓜细胞悬浮培养体系，对其次生代谢的合成进行调控。系统地研究了宣木瓜愈伤组织的诱导条件和疏松愈伤的调控方法以及悬浮培养体系细胞的特点和生长规律等。使用分光光度法测量宣木瓜中齐墩果酸的含量变化，为工厂化生产齐墩果酸提供理论依据。在宣木瓜愈伤组织诱导阶段，比较了不同外植体来源、不同灭菌时间配比、不同的光照条件对宣木瓜愈伤组织诱导率、褐变情况以及生长状态的影响。在诱导培养基MS+2,4-D(1mg mL-1)+KT (0.1mg mL-1)进行诱导培养，幼嫩的茎段以及叶片最容易诱导出愈伤组织。将其作为材料，进行消毒时间的比较，得出叶片的最佳消毒时间为：75%酒精5s和0.1%的升汞5min，茎段的最佳消毒时间为：75%酒精5s和0.1%的升汞10min。诱导时弱光照条件更有利于宣木瓜愈伤组织的诱导。在宣木瓜愈伤组织继代培养阶段，需要调节愈伤组织的状态，从而获得结构疏松、生长旺盛的愈伤组织，为细胞的悬浮培养提供材料。结果表明在最佳继代培养配方： MS+2,4-D(1mg mL-1)+KT (0.5mg mL-1)上进行继代培养，最适合的糖浓度为30g L-1，最佳的pH为5.56.0，对于宣木瓜细胞继代培养的时间，20d左右为最佳继代时间。比较了光照条件对愈伤组织生长的影响，同时绘制了在30天内的动态生长曲线。愈伤组织在这个培养阶段中都呈现出“S”型生长曲线，但是光照条件明显有利于细胞的生长，但是在后期褐变较严重。建立宣木瓜细胞悬浮培养体系，研究了不同的接种量、碳源的种类及其浓度、培养过程中pH的变化等因素对细胞悬浮培养体系的影响，同时还测定了悬浮培养过程中细胞的动态生长曲线以及活性物质的含量。结果表明：以MS为基本培养基不加琼脂，配制成液体培养基，最适合的接种量为4g flask-1，最有利于细胞生长的碳源是麦芽糖，但是活性物质产量最高的为蔗糖，因此选择蔗糖为宣木瓜悬浮培养的碳源。最合适的碳源浓度为20g L-1，活性物质的产量达到了0.5g L-1。最适合细胞生长的pH为5.5，此时细胞的活性物质产量也达到了最大，为0.42g L-1。通过二步培养法对宣木瓜进行悬浮培养，通过比较，得出在悬浮培养后5d更换新鲜的培养液可以有效地加快细胞的生长速度以及活性物质的积累。比较不同MS培养基浓度对悬浮培养的影响发现，MS是最佳的培养液浓度，光照对悬浮细胞的生长有明显的促进作用。建立悬浮生长曲线，同时测定培养过程中细胞生长、pH以及活性物质积累的变化。以30d为测定周期，细胞的生长在09d为生长迟滞期，在915d为快速生长期，此后细胞的生长逐渐减慢。悬浮液的pH在培养周期中先降低，后升高，再降低。用分光光度法，对前面获得的细胞中齐墩果酸的含量进行，发现在27d时细胞中的活性物质的含量及其产量都达到了最大值。