论文摘要
目的采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,建立椎动脉缺血型颈椎病（Cervical Spondylosis of Vertebral Artery,CSA）肝阳化风证和肝阳上亢证及健康对照组高分辨率的二维凝胶电泳图谱,比较3组蛋白质组的表达异同,对差异表达的蛋白质进行质谱分析和数据库搜索,初步确定椎动脉缺血型颈椎病肝阳化风证患者外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）中差异表达的蛋白质,从同病异证的角度为阐明中医肝阳化风证的本质奠定基础。方法设颈椎病肝阳化风证组、颈椎病肝阳上亢证组及健康人对照组3组,取外周静脉血分离单个核细胞提取蛋白质,经双向凝胶电泳,考马斯亮蓝染色获取凝胶图谱,以PDQuest V7.3.1软件对三组表达图谱进行差异分析,选定差异蛋白点进行质谱分析和SWISS-PROT数据库检索鉴定蛋白质。采用逆转录-多聚酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR）技术对差异表达蛋白中的（纤）丝状肌动蛋白成帽蛋白β（F-actin capping proteinsubunit beta,CAPZ-β）在mRNA水平进行验证。结果1.各组PBMCs总蛋白2-DE图谱建立及差异蛋白质识别:分别获得了颈椎病肝阳化风证组、肝阳上亢证组、健康人组PBMCs总蛋白2-DE图谱,通过PDQuest7.3.1分析软件进行点检测,获得了三组图谱的蛋白质点数,健康组587个,肝阳化风证组622个,肝阳上亢证组584个。通过比较分析,差异表达的蛋白质点数为19个,进行质谱鉴定,鉴定出14种蛋白质。肝阳化风组与正常组比较,发现16个蛋白质点在肝阳化风证组中差异表达,3个表达上调,10个表达下调,3个缺失。肝阳上亢证组与正常组比较,发现12个蛋白质点在肝阳上亢证组中差异表达,2个表达上调,6个表达下调,4个缺失。肝阳化风证组与肝阳上亢证组比较,分析发现16个差异表达蛋白点,3个表达相同蛋白质点。鉴定出的蛋白质涉及凋亡相关蛋白、抗氧化蛋白、细胞信号转导蛋白、细胞骨架蛋白、假想和未知蛋白等。2.RT-PCR验证差异蛋白CAPZ-β表达结果:与正常组比较,肝阳上亢证组和肝阳化风证组CAPZ-β表达量均明显增加（P<0.05）,肝阳上亢证组与肝阳化风证组比较,后者CAPZ-β表达量明显高于肝阳上亢证组（P<0.05）,与蛋白质组学检测结果一致。结论1.初步建立了椎动脉缺血型颈椎病肝阳化风证和肝阳上亢证的双向凝胶电泳图谱。2.椎动脉缺血型颈椎病肝阳上亢证与肝阳化风证（肝阳风化证由肝阳上亢证发展而来）有相同表达的蛋白,提示同病异证有相同的物质基础,但肝阳上亢与肝阳化风为中医不同证型,两组图谱及蛋白质表达具有明显差异,提示肝阳化风证和肝阳上亢证又有不同的本质内涵。3.CAPZ-β的RT-PCR结果验证与蛋白质组学检测结果一致,证明了蛋白质组学技术的稳定性及结果的可靠性。肝阳上亢证与肝阳化风证均有CAPZ-β表达上调,提示肝阳化风证由肝阳上亢证发展而来,具有相关证的相同的物质基础,但该蛋白肝阳化风证中又较肝阳上亢证表达上调更明显,提示同病异证（同一疾病,不同阶段）有不同的本质内涵。此研究为中医肝阳化风证本质研究提供了科学依据。
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