吡喹酮抑制日本血吸虫病小鼠肝脏纤维化和炎症应答的作用及机制

论文摘要

日本血吸虫病造成的病理损伤主要是沉积在肝脏中的血吸虫虫卵形成的肉芽肿反应以及持续慢性感染引起的组织损伤修复过度,进而形成的肝脏纤维化。研究表明,血吸虫感染早期的炎症应答不仅介导了感染急性期虫卵肉芽肿的形成,还启动了纤维化相关细胞的活化和基因的表达。与其他病因导致的肝脏纤维化类似,血吸虫慢性感染引起持续的炎症反应造成肝星状细胞（HSCs）的持续激活,分泌大量胶原,同时胶原降解能力受到抑制,导致细胞外基质的大量沉积,形成肝脏纤维化。人群调查均发现,血吸虫病病原治疗之后,肝脏纤维化仍可持续发展,并可能导致肝硬化和肝癌而最终危及生命。因此,在病原治疗之后,进行抗炎治疗和抗纤维化治疗对于抑制过度的虫卵肉芽肿炎症反应和减轻随之而来的肝脏纤维化,阻止肝脏病变的持续发展是治疗血吸虫患者迫切需要的环节。吡喹酮作为安全、有效的抗血吸虫药物已经应用了几十年。以往的研究表明,吡喹酮的杀虫治疗可以减轻血吸虫病肝脏纤维化的程度,其机制在于杀灭了成虫而减少了虫卵在肝脏的沉积。近年来,有研究者提出吡喹酮可能具有抗炎的作用,并可能直接作用于宿主的组织和细胞发挥药效。也有研究者提出吡喹酮也可能具有免疫调节作用。然而,吡喹酮能否直接抑制肝脏炎症和纤维化尚没有报道,其对宿主组织、细胞的作用及可能的作用机制也不明确。如果安全、廉价的吡喹酮具有抗炎或者抗纤维化的作用,那将可能提出治疗血吸虫病的新策略,并有可能成为有希望的抗炎或者抗纤维化药物,应用于其他疾病的炎症和纤维化病变中。因此,本研究拟制作感染血吸虫不同时期小鼠肝星状细胞的基因芯片,期望通过分析从中寻找到血吸虫病致肝脏纤维化中的关键基因。同时,建立血吸虫感染小鼠急性期模型和慢性期模型,给予吡喹酮抗炎和抗纤维化治疗,评价吡喹酮的抗炎和抗纤维化作用。我们也建立CCL4诱导的小鼠肝脏纤维化模型,给予吡喹酮抗纤维化治疗,以进一步明确吡喹酮的抗纤维化作用。此外,我们也进一步研究了吡喹酮对巨噬细胞和肝星状细胞的作用,从细胞水平揭示吡喹酮的抗炎和抗纤维化作用,探讨其可能的机制。为此,本文进行了以下几个方面的研究。一、日本血吸虫病小鼠肝星状细胞表达趋化因子及受体的研究我们利用基因芯片技术描绘了血吸虫病不同阶段小鼠原代肝星状细胞的动态表达谱特征,并着眼于肝星状细胞表达的趋化因子家族成员的动态变化,以Quantigene Plex System高通量技术对部分结果进行验证,再通过生物信息学分析描述其在血吸虫感染不同阶段可能的功能作用。我们也检测了吡喹酮病原治疗后血吸虫病小鼠肝星状细胞的基因芯片,通过与未治疗组的对比分析推测差异基因在肝脏纤维化转归中可能的功能作用。我们的结果显示,绝大多数的趋化因子及受体,如CXCL5、CCL5、CXCR2、CCR9、CCR7、CCL22、CCR1、CCR2、CCL8、CCL17等在感染3周小鼠HSCs中表达较正常对照组显著上调,预示着感染早期趋化因子可能介导了免疫细胞浸润和肝脏炎性免疫微环境的形成。感染6周小鼠HSCs中部分趋化因子,如CXCL9、CXCL10、CXCL11、CCR2、CCR5、CXCR3等的表达较正常对照组呈现显著的下调,这也提示在虫卵肉芽肿形成时期,肝脏内趋化因子呈现表达抑制的特征,这很有可能与大量沉积的虫卵释放的抗原有关,同时也避免机体因为过度的免疫应答而导致死亡。随着感染进入慢性期,HSCs表达的多数趋化因子,如CCL5、CCL8、CCL9、CCL21、CXCL5和CCR1等均呈现持续高表达的特征,这与血吸虫病慢性期肝脏纤维化的持续发展密切相关。在吡喹酮病原治疗后的小鼠HSCs芯片中我们发现,多数趋化因子都显著上调,如CXCL9、CXCL10、CCL3、CCL4、CCL5、CCR3、CCL24、CCL17、CCL22等,其很可能与肝脏纤维化的逆转相关,同时一些以的芯片结果初步揭示了在血吸虫病肝纤维化中可能发挥作用的趋化因子家族成员,为下一步的深入研究提供了有益的线索。此外,我们也在体外试验中初步证实了趋化因子CXCL9和CXCL10的抗纤维化作用,其可以抑制血吸虫感染小鼠肝脏非实质细胞表达胶原等纤维化相关基因的水平,也可以抑制TGF-β激活的人肝星状细胞系LX-2表达胶原等基因的水平,其作用的受体以及下游的信号通路还有待进一步研究,以全面的阐明趋化因子与血吸虫病肝脏纤维化的关系。二、吡喹酮抗肝纤维化作用及其机制的研究我们建立日本血吸虫病小鼠慢性期和晚期肝脏纤维化模型,并以吡喹酮进行长期抗纤维化治疗（30天）。我们发现与以往的病原治疗不同的是,吡喹酮长期抗纤维化治疗感染日本血吸虫8周和15周小鼠后,肝脏胶原的面积和羟脯氨酸的含量显著减少;慢性期肿大的脾脏明显缩小;血清ALT的水平降低;晚期门脉高压症也得到缓解,同时也抑制了HSCs激活水平以及纤维化相关基因的表达。吡喹酮长期抗纤维化治疗同样也减小了四氯化碳诱导的肝纤维化小鼠肝脏胶原的面积和羟脯氨酸的含量,降低了血清ALT/AST的水平。我们的研究表明,吡喹酮具有直接的抗肝脏纤维化作用,并可能是通过抑制肝星状细胞的激活水平而发挥作用。三、吡喹酮调节日本血吸虫病小鼠肝脏炎性应答的特征我们建立日本血吸虫病小鼠急性期炎症模型,并以吡喹酮进行7天的抗炎治疗。我们发现与以往的病原治疗不同的是,吡喹酮抗炎治疗显著地抑制了肝脏炎性因子TNF-α、IL-6和趋化因子CCL2、CCL3、CCL5等基因的表达水平,发挥了抑制炎症反应的作用。体外试验也显示,吡喹酮可以抑制感染日本血吸虫小鼠肝脏非实质细胞和脾脏细胞炎性因子和趋化因子的表达水平。进一步的体外试验发现,吡喹酮可以抑制巨噬细胞表达炎性因子TNF-α的水平,这也可能是吡喹酮调节炎性应答的机制之一。综上所述,本研究应用基因芯片技术描绘了日本血吸虫病不同感染阶段肝星状细胞的动态表达谱特征,并着眼于趋化因子在其中的功能作用,进行了生物信息学分析,初步研究了部分趋化因子对肝脏纤维化相关细胞的影响。同时,我们研究了吡喹酮可能的新作用,初步揭示了吡喹酮具有抗肝脏纤维化作用,以及对炎症应答的调节作用,为以吡喹酮作为抗纤维化和抗炎的药物应用提供理论依据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 日本血吸虫病小鼠肝星状细胞表达趋化因子及受体的研究
• 摘要
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 吡喹酮抗日本血吸虫病肝纤维化作用及其机制的研究
• 摘要
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 吡喹酮调节日本血吸虫病小鼠肝脏炎性应答的特征
• 摘要
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 综述
• 参考文献
• 附录
• 致谢