论文摘要
研究背景肝移植已经成为治疗多数急、慢性终末期肝病的首选方法。但是存在于每一例肝移植过程中的缺血再灌注损伤（IRI）仍然是原发性移植物功能不良或无功能的主要原因。供体的短缺使得移植中心不断扩大使用边缘供体的尺度,包括老龄供体、无心跳供体、小体积供肝及脂肪肝。而边缘供体带来的基本问题仍然是IRI。因此,最大限度的减轻IRI不但可以增加适当的供体,也可以使更多的病人从肝移植手术中康复。而实现这一愿望的首要步骤就是更加充分的理解I/R损伤的机制。肝脏是对缺血再灌注损伤最敏感的器官之一。肝窦内皮细胞、Kupfer cells和中性粒细胞的活化以及氧自由基的产生在缺血再灌注损伤的病理过程中具有重要作用。氧自由基和炎症细胞因子、粘附分子进一步促进中性粒细胞的活化与聚集,介导脂质过氧化损伤等过程,最终导致肝组织损伤。1997年发现的Toll样受体系统（TLRs）在感染和炎症性疾病中扮演重要角色。其中的TLR-4信号通路被认为在心脏、肾脏和肝脏的IRI病理生理过程中居主导地位。TLR-4分子存在于所有肝实质、非实质细胞上,每种肝细胞群体都拥有完整的TLR-4信号通路。激活的肝脏非实质细胞（尤其Kupffer细胞）通过TLR-4信号通路在肝脏热缺血再灌注损伤中发挥重要作用。TLR-4的激活引出NF-κB激活,进一步触发TNF-a、IL-1、IL-6等炎症因子的大量产生。因为TLR-4信号通道在肝脏缺血再灌注损伤中的重要作用,通过抑制该信号通路达到减轻肝脏IRI的目的就显得前景诱人。HO-1是热休克蛋白32成员,肝脏HO-1最初由Kupffer细胞产生,作为TLR-4的配体之一,通过阻抑TLR-4信号通路产生较强的抗氧化、抗炎症功能从而起到保护肝脏IRI的作用。另一方面,细胞因子信号转导抑制分子1（Supressors of cytokine signalingl,SOCS1）是一种负性调节因子。能通过负性调控JAK-STAT信号途径而抑制ILs、IFN-γ、GH等多种细胞因子的信号转导途径。SOCS1还参与其它信号途径的调节,如TNF-a、LPS等。SOCS1的过表达在体外能明显减轻TNF-a引起的肝细胞凋亡,而TNF-a被认为是TLR-4活化的标志。提示SOCS1可能是负调节TLR-4及其信号转导系统的内源性因子之一。研究显示IL-10能够促进SOCS蛋白的产生,尤其是SOCS1和SOCS3。研究者在包括肝脏的许多缺血再灌注损伤模型中都能观察到IL-10的抑制炎症、保护组织的作用。因此如有药物能促进体内IL-10表达,则可能通过SOCS1负调节信号通道在肝脏IRI中发挥保护作用。落新妇甙（Astilbin）是从土茯苓的乙醇提取液中分离得到的3个二氢黄酮醇甙之一。黄酮类化合物有较强的抗氧化作用,可作为递氢体清除氧自由基,从而在抗炎、减轻缺血再灌注损伤等方面发挥作用。研究证实其具有利尿、镇痛、抗炎及减轻心肌细胞缺血再灌注损伤的作用。有研究报道落新妇甙能够通过干预氧自由基和脂质过氧化物生成,明显减轻四氯化碳（CC14）引起的肝损伤;在刀豆球蛋白A（Con A）诱导肝炎后,落新妇甙能够显著降低TNF-a的生成和肝脏Kupffer细胞的增殖,并且落新妇甙在接触性皮炎模型中能显著促进IL-10和SOCS1和SOCS3的表达,减轻炎症反应。基于上述研究背景,本课题进一步研究:1)落新妇甙对肝脏热缺血再灌注损伤的保护效果,包括肝功能、肝脏病理、SOD、MDA、MPO的检测;2)落新妇甙对肝脏缺血再灌注损伤模型中TLR-4、HO-1、NF-κB、TNF-a等分子蛋白和mRNA水平表达的影响,探讨其抑制炎症信号通路的分子机制;3)落新妇甙对IL-10、SOCS1蛋白和mRNA表达的影响,探讨其促进抑炎信号通路的分子机制。通过上述研究,为以后在同种异体小鼠肝移植模型中研究落新妇甙对缺血再灌注损伤保护,免疫抑制效果及机制进行基础准备。第一部分落新妇甙对肝脏热缺血再灌注损伤的干预作用目的:探讨落新妇甙在肝脏热缺血再灌注损伤中对肝功能和肝组织的保护效果。方法:C57BL/6小鼠随机分为4组（n=8）:假手术组（Sham）、模型组（I/R）、落新妇甙小剂量（10mg/kg）干预组和落新妇甙大剂量（40mg/kg）干预组。缺血前24小时和1小时干预组小鼠腹腔注射分别给予10或40mg/kg的落新妇甙,建立肝左、中叶70%部分肝缺血再灌注模型,模型组和假手术组给予同样体积的生理盐水。小鼠肝脏左叶缺血90min、再灌注6h后各实验组采集血液和肝脏组织样本。检测血清中ALT活性作为肝功能损伤的指标,同时用ELISA检测肝组织中MPO、SOD和MDA含量。肝脏组织病理学检测。结果:与模型对照组相比,小、大剂量落新妇甙干预组血清ALT含量均明显下降（P＜0.01）,大剂量干预组较小剂量组更明显（P＜0.01）;落新妇甙大剂量干预后肝脏组织病理学表现明显改善;落新妇甙干预后肝组织MPO、MDA含量较模型对照组明显下降（P＜0.01）,大剂量干预组较小剂量组更明显（P＜0.01）;而SOD含量明显上升（P＜0.01）,大剂量干预组较小剂量组明显（P＜0.05）。结论:落新妇甙干预能有效改善小鼠肝脏热缺血再灌注损伤引起的肝功能和肝脏病理损害;落新妇甙干预能够减轻小鼠肝脏热缺血再灌注损伤后中性粒细胞的聚集浸润和活化,从而减轻炎症反应;落新妇甙能减少缺血再灌注后氧自由基的产生,减轻脂质过氧化引发的组织损伤。第二部分落新妇甙对肝缺血再灌注损伤TLR-4信号通路的抑制作用目的:通过观察落新妇甙对肝脏热缺血再灌注损伤中炎症信号通路的影响,探讨其缺血再灌注保护作用的分子机制。方法:C57BL/6小鼠随机分为4组（n=5）:假手术组（Sham）、模型组（I/R）、落新妇甙小剂量（10mg/kg）干预组和落新妇甙大剂量（40mg/kg）干预组。缺血前24小时和1小时干预组小鼠腹腔注射分别给予10或40mg/kg的落新妇甙,建立肝左、中叶70%部分肝缺血再灌注模型,模型组和假手术组给予同样体积的生理盐水。小鼠肝脏左叶缺血90min、再灌注6h后各实验组采集血液和肝脏组织样本。检测血清中TNF-a活性,Westernblot检测肝组织中TNF-a、TLR-4、NF-κB和HO-1蛋白含量,半定量RT-PCR检测上述分子mRNA表达情况。结果:落新妇甙小、大剂量干预后血清TNF-a含量较I/R对照组均明显下降（P＜0.01）,且呈现剂量—效益关系（P＜0.01）;落新妇甙小、大剂量干预组肝组织中TNF-a、TLR-4、NF-κB蛋白表达与I/R模型对照组比较均渐次降低,与半定量RT-PCR结果相符（小剂量干预组P＜0.05;大剂量干预组P＜0.01）;而落新妇甙小、大剂量干预组肝组织中HO-1蛋白表达与I/R模型对照组比较均渐次升高,亦与半定量RT-PCR结果相符（小剂量干预组P＜0.05;大剂量干预组P＜0.01）。结论:落新妇甙干预能降低缺血再灌注损伤引起的血清TNF-a水平升高以及TNF-a蛋白及mRNA在肝组织中的高表达,从而减轻由TNF-a介导的进一步损伤;落新妇甙干预能降低IRI肝组织中TLR-4蛋白、mRNA和NF-κB蛋白的高表达,显示其对TLR-4炎症信号通路具有抑制作用。落新妇甙干预能促进IRI肝组织HO-1蛋白和mRNA的表达,显示其对TLR-4通路的抑制与促进HO-1的表达密切相关。第三部分落新妇甙对肝缺血再灌注损伤SOCS1、IL-10表达的影响目的:通过观察落新妇甙对肝脏热缺血再灌注损伤中抑炎症信号通路的影响,进一步探讨其缺血再灌注保护作用的分子机制。方法:C57BL/6小鼠随机分为4组:假手术组（Sham）、模型组（I/R）、落新妇甙小剂量（10mg/kg）干预组和落新妇甙大剂量（40mg/kg）干预组。缺血前24小时和1小时干预组小鼠腹腔注射分别给予10或40mg/kg的落新妇甙,建立肝左、中叶70%部分肝缺血再灌注模型,模型组和假手术组给予同样体积的生理盐水。小鼠肝脏左叶缺血90min、再灌注6h后各实验组采集血液和肝脏组织样本。Westernblot检测肝组织中SOCS-1、IL-10蛋白含量,半定量RT-PCR检测上述分子mRNA表达情况。结果:落新妇甙小、大剂量干预组肝组织中SOCS-1、IL-10蛋白表达与I/R模型对照组比较均渐次升高,与半定量RT-PCR结果相符（小剂量干预组P＜0.05;大剂量干预组P＜0.01）。结论:落新妇甙干预能促进缺血再灌注损伤肝组织中IL-10蛋白及mRNA在的高表达,从而起到抑制炎症的作用;落新妇甙干预能促进缺血再灌注损伤肝组织SOCS1蛋白和mRNA的表达,显示其可能通过上调SOCS1负调节通路产生抑制炎症的作用。
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标签：肝脏缺血再灌注损伤论文; 落新妇甙论文; 半定量论文;