黑龙江省瓜类白粉病菌生理小种鉴定及其多样性分析

论文摘要

白粉病是瓜类作物广泛发生的一种世界性病害,温室及露地均可发生,由于为害瓜类作物的白粉病菌生理小种分化快,所以明确当地白粉病菌生理小种及其地理分布对引进抗源材料,开展抗病育种及防治等方面均具有重要意义。应用分子标记辅助育种可提高选择效率,加快新抗病品种的培育。本实验比较了三种不同纯化保存白粉病菌的方法,结果显示,活体保存法保存时间最长约为3个月,离体打孔法保存时间最短约为1个月,MS添加激素IAA叶碟保存法可大约保存1.5个月,最适合子叶生根的激素IAA浓度为1.5mg/l。三种方法各有利弊,应根据需要选择合适的保存方法。2010年采集黑龙省不同生态区不同设施内的甜瓜、黄瓜、南瓜、西瓜等瓜类白粉病病菌17份,利用国际通用的瓜类白粉病鉴定标准对其进行生理小种鉴定,根据13个鉴别寄主的抗感反应,初步确定黑龙江省瓜类白粉病菌存在3个生理小种,即单囊壳白粉菌（Podosphaera xanthii）的生理小种1和生理小种N1,还有一个新生理小种,其中优势小种是生理小种1。对其中部分白粉病菌进行RAPD分析,从119个随机引物中筛选出10个条带清晰重复性好的引物,扩增得到157个位点,其中多态性位点为138个,多态性位点频率为97.89%,说明黑龙江省葫芦科作物白粉菌有丰富的遗传多样性。利用NTSYS-PC软件进行数据分析,结果表明:供试菌株之间遗传相似系数的变化幅度为0.52-0.75,根据遗传相似系数用类平均法（UPGMA）对其聚类,以遗传相似系数0.60为阈值,供试菌株可区分为4个类群。同是生理小种1的菌株部分聚到了同一类,新生理小种与部分生理小种1菌株聚到同一类,同是生理小种N1的两个菌株未聚到同一类;相同地理来源或相同寄主来源的白粉菌也未聚到一类。初步确定瓜类白粉病菌群体基因型与致病性之间不形成对应关系,与菌株地理来源、寄主来源及设施类型亦无明显直接关系。应用通用引物对部分黑龙江省瓜类白粉病菌进行转录单位间隔区（IGS）分析,结果表明,不同菌株的IGS区存在长度异质性和数量多态性。应用MspⅠ, AsuⅠ, Hinp1Ⅰ3个限制性内切酶对IGS扩增产物进行酶切（IGS-RFLP）,不同菌株的酶切位点不同,电泳后产生多样性丰富的图谱,成为菌株特有的DNA指纹,实验所用的3个限制性内切酶都可以有效地将供试菌株加以鉴别,但未发现不同小种间的特异性标记。利用NTSYS-PC软件对IGS1-RFLP酶切图谱进行数据分析,各菌株之间遗传相似系数的变化幅度为0.46-0.80,说明白粉菌间有丰富的遗传多样性,以遗传相似系数0.60为阈值,供试菌株可区分为3个类群,初步确定瓜类白粉病菌群体基因型与致病性之间不形成对应关系,与菌株地理来源、寄主来源及设施类型亦无明显直接关系。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 白粉病病原菌与生理小种鉴定的研究
• 1.1.1 瓜类白粉病病原菌的种类及特性
• 1.1.2 葫芦科白粉病生理小种鉴定的研究
• 1.1.3 白粉病菌的侵染特点及其发病症状
• 1.1.4 白粉病传播途径和发病条件
• 1.1.5 白粉病菌菌种保存
• 1.2 生理小种
• 1.2.1 生理小种概念
• 1.2.2 生理小种的鉴定
• 1.2.3 利用生理小种鉴定抗病基因
• 1.2.4 生理小种鉴定的意义
• 1.3 抗病鉴定接种方法
• 1.3.1 风媒接种法
• 1.3.2 干孢子粉直接接种法
• 1.3.3 孢子悬浮液喷雾接种法
• 1.3.4 离体打孔叶盘接种法
• 1.4 分子标记技术及在真菌中的应用
• 1.4.1 核酸序列分析
• 1.4.2 限制性片段长度多态性（RFLP）
• 1.4.3 随机扩增多态性（RAPD）
• 1.4.4 扩增片段长度多态性（AFLP）
• 1.4.5 微卫星技术（SSR）
• 1.4.6 简单序列重复区间（ISSR）
• 1.4.7 序列特征扩增区域（SCAR）
• 1.5 试验目的意义及主要内容
• 1.6 技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 菌株保存与纯化
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 活体保存法
• 2.1.3 MS 培养基加激素IAA 叶碟保存法
• 2.1.4 离体叶盘接种法
• 2.2 黑龙江省瓜类白粉病生理小种的鉴定
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 试验设计
• 2.2.3 病原菌的显微镜检
• 2.2.4 接种
• 2.2.5 病情指数调查
• 2.3 黑龙江省瓜类白粉病菌RAPD 分析
• 2.3.1 供试材料
• 2.3.2 试验主要仪器设备和试剂
• 2.3.3 供试菌株DNA 的提取
• 2.3.4 DNA 纯度检测
• 2.3.5 引物合成及筛选
• 2.3.6 RAPD 扩增
• 2.3.7 扩增产物的检测
• 2.3.8 RAPD-PCR 数据分析
• 2.4 黑龙江省瓜类白粉病菌的IGS-RFLP 分析
• 2.4.1 试验材料
• 2.4.2 主要试验试剂仪器
• 2.4.3 菌株DNA 提取
• 2.4.4 DNA 纯度检测
• 2.4.5 IGS 引物合成
• 2.4.6 IGS 扩增
• 2.4.7 IGS 扩增产物的限制性酶切
• 2.4.8 IGS-RFLP 酶切产物检测
• 2.4.9 IGS-RFLP 数据分析
• 3 结果与分析
• 3.1 菌株纯化保存
• 3.1.1 活体保存
• 3.1.2 MS 培养基添加激素IAA 叶蝶保存法
• 3.1.3 离体叶盘保存法
• 3.2 黑龙江省瓜类白粉病菌生理小种鉴定
• 3.2.1 白粉病菌显微镜检
• 3.2.2 黑龙江省瓜类白粉病菌生理小种鉴定
• 3.3 白粉病菌RAPD 分析
• 3.3.1 供试菌株总DNA 的提取
• 3.3.2 RAPD 扩增体系及程序的优化
• 3.3.3 引物筛选和RAPD 扩增
• 3.3.4 聚类分析
• 3.3.5 白粉病菌群体基因型与致病性之间的相关性
• 3.3.6 白粉菌群体基因型的划分与寄主、地域、设施之间的相关性
• 3.4 白粉菌IGS-RFLP 分析
• 3.4.1 DNA 的提取
• 3.4.2 IGS-RFLP 分析
• 3.4.3 聚类分析
• 3.4.4 白粉病菌群体基因型与致病性之间的相关性
• 3.4.5 白粉病菌群体基因型划分与寄主、地域、设施之间的相关性
• 4 讨论
• 4.1 白粉病菌纯化保存
• 4.2 黑龙江省瓜类白粉病菌生理小种的鉴定
• 4.3 黑龙江省瓜类白粉病菌RAPD 分析
• 4.4 黑龙江省瓜类白粉病菌IGS-RFLP 分析
• 4.5 白粉病菌群体基因型与致病性之间的相关性
• 4.6 白粉病菌群体基因型划分与寄主、地域、设施之间的相关性
• 4.7 RAPD 与 IGS-RFLP 两种分析方法比较
• 4.8 本研究的创新点
• 5 结论
• 5.1 白粉病菌纯化保存
• 5.2 黑龙江省瓜类白粉病菌生理小种鉴定
• 5.3 黑龙江省瓜类白粉病菌RAPD 分析
• 5.4 黑龙江省瓜类白粉菌IGS-RFLP 分析
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间发表学术论文