分布于沙漠和戈壁的沙冬青和四合木活性物质的超量积累及对衰老进程调控的分析研究

论文摘要

沙冬青和四合木分布于我国西北和蒙古的沙漠和戈壁地区，是耐极度干旱、极端温度、贫瘠和盐碱的孑遗植物。沙冬青在夏季摄氏四十度高温和冬季零下摄氏三十度低温的沙漠上能维持常绿不落叶，被当地居民制成传统药物，用于治疗呼吸道疾病、冻疮、类风湿和止痛等。本研究试图分析这两种极端逆境下植物体内生理活性物质的积累，进而推测沙冬青用于多种传统疾病治疗的可能机理。特别是试图分离鉴定调节衰老进程的生理活性物质，并探索其相关调节机理。利用化学分离的手段，借助于电子顺磁共振波谱法、DPPH染色法和脂质过氧化的方法，通过对各组份浸膏抗氧化活性的分析测定，进而对主要抗氧化成分进行追踪分离。利用不同有机溶剂及其不同配比组合分离获得的浸膏，与对照相比都显示出了较高的清除自由基活性，其中以1份石油醚与1份乙酸乙酯的配比从沙冬青中提取出的浸膏清除自由基活性最高。从高活性组份中继续分离获得了大量的白藜芦醇(占总干重植株的0.05％)以及两种异黄酮。这一结果表明，极端恶劣的生态环境有利于植物中强抗氧化剂的累积；同时也表明沙冬青对多种传统疾病的治疗功效可能与其强抗氧化作用有关。我们进一步研究了各组浸膏对衰老动物模型果蝇的寿限的干扰。结果显示，果蝇寿限的延长或缩短与提取物的浓度呈依赖性关系。不仅如此，沙冬青和四合木提取物显著地降低了第15天龄果蝇体内的SOD和CAT的酶活，表明这些提取物对果蝇寿限的延长很可能是与他们的强抗氧化能力有关。为了进一步探索其延缓衰老的机理，我们分析了主要活性成分白藜芦醇对小鼠胸腺细胞的自发凋亡的影响。实验采用PI染色流式细胞术研究细胞周期与细胞凋亡。结果表明，100，50和20μM的白藜芦醇在48小时之内对胸腺细胞的自发凋亡都有抑制作用。48小时之后，50μM不但没有抑制作用，反而促进胸腺细胞的自发凋亡或死亡。而100μM的白藜芦醇组抑制胸腺细胞的自发凋亡，120小时之后仍有明显效果。100μM的白藜芦醇组在48小时的抑制率为7.86％，在72小时和120小时的抑制率分别为12.23％和11.23％。这一结果表明，主要活性成分白藜芦醇不仅是强抗氧化剂，而且在一定的浓度范围内，还可能是细胞自发凋亡的有效抑制剂。进一步说明上述对寿限延长的效果，还可能与其主要成分白藜芦醇对细胞凋亡的直接抑制有关。

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前言

文献综述

第一部分沙冬青和四合木简介

第二部分自由基衰老理论

氧自由基的性质

氧自由基的代谢

自由基的检测

自由基与衰老

第三部分胸腺保护与抗衰老

第四部分衰老的生物模型—果蝇

第一章沙冬青和四合木生理活性产物的超量积累与活性成分追踪检测

1 引言

2 材料与方法:

2.1 沙冬青和四合木的分离提取及其化学成分分离纯

2.1.1 提取与分离

2.1.2 化合物分离纯化与鉴定

2.2 电子顺磁共振波谱法对提取物悴灭超氧阴离子的活性检测

2.2.1 实验方法

2.2.2 超氧阴离子发生模型配置

2.2.3 超氧阴离子的检测及测试条件

2.2.4 数据转换及处理

2.2.5 增抑作用的计算

2.3 提取物悴灭DPPH·的活性检测

2.3.1 实验材料

2.3.2 实验方法

2.4 脂质过氧化法对提取物的抗氧化活性的检测

2.4.1 实验材料

2.4.2 实验方法

3 实验结果

3.1 提取物的分离提取

3.2 EPR超氧阴离子模型的建立

3.3 悴灭自由基能力与提取物浓度呈依赖性关系

50低于虎皮楠提取物'>3.4 沙冬青和四合木提取物的IC₅₀低于虎皮楠提取物

3.5 提取物有效悴灭DPPH自由基

3.6 提取物有效抑制脂质过氧化

3.7 生理活性产物的分离、纯化与鉴定

3.8 EPR实验中白藜芦醇悴灭效果是维生素E的两到三倍

4 讨论

4.1 逆境生存提高植物非酶系统的悴灭自由基的能力

4.2 逆境生存有利于植物中强抗氧化剂的累积

4.3 悴灭自由基能力与提取物浓度呈依赖性关系

4.4 低浓度的白藜芦醇EPR波谱是具有非典型性的超氧阴离子特征的图谱

第二章沙冬青和四合木提取物对果蝇寿限的干扰及其机理的分析研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 果蝇寿限的确定

2.1.1 实验仪器

2.1.2 实验药品

2.1.3 培养基的配制

2.1.4 实验方法

2.1.5 统计分析

2.2 SOD和CAT活性检测

2.2.1 试剂及配制

2.2.2 实验仪器

2.2.3 酶活力测定

2.2.4 福林-酚法测蛋白

2.2.5 实验方法

3 实验结果

3.1 果蝇寿限的延长或缩短与提取物的浓度呈依赖性关系

3.2 SOD和CAT随果蝇增龄的变化

3.3 提取物降低了果蝇SOD和CAT的酶活

3.4 白藜芦醇延长果蝇寿限同时增加了体重和产卵率

4 讨论

4.1 果蝇寿限的延长或缩短与提取物的浓度呈依赖性关系

4.2 果蝇体内SOD和CAT随增龄的变化的分析

4.3 提取物降低了果蝇SOD和CAT的酶活的分析

4.4 白藜芦醇延长果蝇寿限的机理有待于探索

第三章白藜芦醇抑制小鼠胸腺细胞自发凋亡的研究

1 引言

2 材料与方法

2.1 小鼠胸腺细胞的原代培养

2.1.1 实验器材

2.1.2 实验药品

2.1.3 实验步骤

2.1.4 细胞活力的测定

2.1.5 胸腺细胞复制周期的测定

2.2 MTT法测定白藜芦醇的细胞毒

2.2.1 实验试剂

2.2.2 实验器材

2.2.3 操作步骤

2.3 白藜芦醇对胸腺细胞自发凋亡抑制的测定

2.3.1 实验材料

2.3.2 试剂

2.3.3 实验仪器

2.3.4 实验方法

3 实验结果

3.1 分离得到小鼠原代胸腺细胞

3.2 胸腺细胞复制周期

3.3 DMSO浓度小于0.5%没有细胞毒

3.4 白藜芦醇细胞毒的检测

3.5 PI染色法检测细胞周期

4 讨论

4.1 胸腺细胞的凋亡模型应用广泛

4.2 小鼠原代胸腺细胞的分离鉴定

4.3 白藜芦醇抑制胸腺细胞自发凋亡

总结

参考文献

附录

附录1

附录2

附录3:

攻读博士学位已发表的文章

致谢

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