葛根组分库的建立及雌激素活性的研究

论文题目: 葛根组分库的建立及雌激素活性的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 分析化学

作者: 张岩

导师: 梁鑫淼

关键词: 组分中药,色谱,质谱,转基因酵母,生物转化

文献来源: 中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）

发表年度: 2005

论文摘要: 本文采用组分中药的研究模式,以发展构建中药组分库为核心,采用化学、生物学的方法与技术,阐述中药的药效物质基础。选取葛根为研究对象,探讨了中药组分的分离与表征方法。为了对组分库进行生物学表征,建立了植物雌激素的活性筛选平台-转基因酵母雌激素检测模型。利用该模型,对葛根总提物及不同极性部位进行了雌激素活性的初步筛选。针对葛根总提物的复杂体系,建立了一套稳定、可靠、重现性好的HPLC分析方法。从色谱模式、流动相、添加剂几个方面进行了优化,操作条件的优化是采用五次线性梯度快速准确地获取液相色谱保留参数a,c值以及峰形参数sigma,tau的基础上,使用CSA软件高精度仿真、调整、优化梯度条件。利用优化后的色谱条件,对葛根总提物及不同的极性部位进行了HPLC-UV-DAD的化学表征,并将其物质基础与活性进行了关联。发展了HPLC-APCI-MS联用技术分析葛根总提物的方法。应用工业色谱及相关技术,发展了高效的规模组分制备分离方法,获取了29个乙酸乙酯部位和18个正丁醇部位的制备组分。利用色谱及其联用分析技术,实现了组分的高通量化学表征;利用雌激素检测模型,实现了组分的雌激素活性的高通量的生物学表征,筛选出了12个活性组分,并将组分的物质基础与活性进行了关联。为了提高葛根异黄酮的生物利用度,采用从微生物中制备的酶对葛根进行了生物转化的研究。对酶解条件进行了优化,比较了酶解前后葛根雌激素活性的变化。采用HPLC-APCI-MS技术中的选择离子监测模式,从分析化学的角度,阐明了物质转化的过程。

论文目录:

第一章 文献综述

1.1 引言

1.2 中药研究概况

1.2.1 国内外中药研究现状与发展动态

1.2.2 现代中药的研究模式

1.2.3 中药研究中存在的问题

1.3 高效液相色谱（HPLC）及其联用技术在中药化学表征中的应用

1.3.1 高效液相色谱

1.3.2 LC-MS 联用技术

1.4 药物筛选模型和技术在中药活性成分研究中的应用

1.4.1 整体动物筛选模型

1.4.2 受体、酶等生物分子筛选模型和分子生物色谱

1.4.3 细胞模型和细胞膜色谱

1.4.4 基因芯片技术

1.5 植物雌激素研究概况

1.5.1 植物雌激素与雌激素替代疗法

1.5.2 植物雌激素的种类及结构

1.5.3 植物雌激素在体内的吸收及代谢转化

1.5.4 植物雌激素对雌激素依赖性疾病的防治作用

1.6 植物雌激素与相关中药研究

1.6.1 中药传统药效与植物雌激素

1.6.2 中药植物雌激素的研究前景

1.7 中药葛根研究概况

1.7.1 葛根的化学成分

1.7.2 葛根的药理研究

1.8 本课题的提出

参考文献

第二章 雌激素活性筛选平台的建立及葛根雌激素活性的初步测定

2.1 引言

2.2 转基因酵母雌激素活性检测模型的建立及方法改进

2.2.1 实验部分

2.2.1.1 主要试剂

2.2.1.2 主要仪器

2.2.1.3 各种缓冲液、检测液及培养基配方

2.2.1.4 菌种

2.2.1.5 被测样品的配制

2.2.1.6 酵母菌种的培养

2.2.1.7 β-半乳糖苷酶测定步骤

2.2.2 酶活的计算

2.2.2.1 酶活的计算公式

2.2.2.2 相对酶活与相对诱导效应

2.2.3 数据处理与分析

2.2.3.1 EC50 的计算

2.2.3.2 相对效力

2.2.4 结果与讨论

2.2.4.1 转基因酵母法检测植物雌激素

2.2.4.2 三种方法测定β-半乳糖苷酶的比较

2.2.4.3 改进的酶法破壁的方法的优化与评价

2.3 葛根提取物的雌激素活性的初步检测

2.3.1 实验部分

2.3.1.1 仪器与试剂

2.3.1.2 葛根总提物及不同极性部位的制备

2.3.1.3 标准对照品的雌激素活性检测

2.3.1.4 葛根总提物及不同极性部位的雌激素活性检测

2.3.2 酶活的计算

2.3.3 数据处理与分析

2.3.4 结果与讨论

2.3.4.1 17β-雌二醇及标准对照品的雌激素活性检测

2.3.4.2 葛根总提物及不同极性提取物的雌激素活性

2.4 小结

参考文献

第三章 葛根分析方法的建立

3.1 引言

3.2 色谱分析方法的确立

3.2.1 实验部分

3.2.1.1 仪器与试剂

3.2.1.2 样品制备

3.2.1.3 色谱条件优化

3.2.1.4 数据处理

3.2.2 结果与讨论

3.2.2.1 色谱模式及色谱柱的选择

3.2.2.2 流动相的优化

3.2.2.3 操作条件的优化

3.2.2.4 方法的重现性和精密度

3.3 葛根提取组分的HPLC-DAD-UV 分析

3.3.1 实验部分

3.3.1.1 仪器与试剂

3.3.1.2 样品制备

3.3.1.3 葛根总提物及不同极性部位的HPLC 分析

3.3.1.4 理论相对诱导效应（RIE）的计算

3.3.2 结果与讨论

3.3.2.1 葛根总提物的HPLC-DAD-UV 分析

3.3.2.2 葛根不同极性部位的HPLC-DAD-UV 分析

3.3.2.3 分析数据与活性数据的关联

3.4 小结

参考文献

第四章 葛根组分库的建立

4.1 引言

4.2 液相制备色谱制备葛根组分的方法策略

4.2.1 线性放大技术在制备色谱中的应用

4.2.2 高效液相制备色谱制备葛根组分的方法策略

4.3 葛根乙酸乙酯部位的组分库的建立

4.3.1 实验部分

4.3.1.1 仪器与试剂

4.3.1.2 乙酸乙酯部位的制备

4.3.1.3 乙酸乙酯部位的预处理

4.3.1.4 优化分析型液相色谱条件

4.3.1.5 制备色谱分离条件

4.3.1.6 制备组分的收集

4.3.1.7 制备组分的HPLC 分析

4.3.2 结果与讨论

4.3.2.1 乙酸乙酯部位的预处理

4.3.2.2 分析条件的优化

4.3.2.3 线性放大到制备型色谱

4.3.2.4 组分收集

4.3.2.5 葛根乙酸乙酯组分的化学指纹谱

4.4 葛根正丁醇部位的组分库的建立

4.4.1 实验部分

4.4.1.1 仪器与试剂

4.4.1.2 正丁醇部位的制备

4.4.1.3 正丁醇部位的预处理

4.4.1.4 优化分析型液相色谱条件

4.4.1.5 制备色谱分离条件

4.4.1.6 制备组分的收集

4.4.1.7 制备组分的HPLC 分析

4.4.2 结果与讨论

4.4.2.1 分析条件的优化

4.4.2.2 线性放大到制备型色谱

4.4.2.3 组分收集

4.4.2.4 葛根正丁醇部位制备组分的化学指纹谱

4.5 小结

参考文献

第五章 葛根乙酸乙酯部位组分库的雌激素生物活性筛选

5.1 引言

5.2 实验部分

5.2.1 仪器与试剂

5.2.2 乙酸乙酯部位组分库的YES 筛选

5.2.3 活性组分的HPLC-MS 分析

5.3 结果与讨论

5.3.1 乙酸乙酯部位组分库的雌激素活性的筛选

5.3.2 活性数据与HPLC 分析数据的关联

5.3.3 YC18-25 中可疑化合物X 的确认

5.4 小结

参考文献

第六章 高效液相色谱/质谱联用技术在葛根成分分析中的应用

6.1 引言

6.2 实验部分

6.2.1 仪器与试剂

6.2.2 色谱条件

6.2.3 质谱条件

6.3 结果与讨论

6.3.1 质谱条件的优化

6.3.2 几种典型异黄酮的LC-MS和LC-MS-MS分析

6.3.3 葛根总提物的LC/MS(MS)分析

6.4 小结

参考文献

第七章 葛根异黄酮的生物转化

7.1 引言

7.2 葛根酶解条件的研究

7.2.1 实验部分

7.2.1.1 仪器与试剂

7.2.1.2 样品制备

7.2.1.3 菌种的培养及酶液的提取

7.2.1.4 葛根的酶解

7.2.1.5 HPLC 分析酶解产物

7.2.2 结果与讨论

7.2.2.1 微生物酶的应用

7.2.2.2 葛根异黄酮酶解的化学结构基础

7.2.2.3 葛根总提物酶解条件的考察

7.2.3 结论

7.3 葛根生物转化后的雌激素活性与物质成分的变化

7.3.1 实验部分

7.3.1.1 仪器与试剂

7.3.1.2 样品制备

7.3.1.3 菌种的培养和酶液的提取

7.3.1.4 葛根的酶解

7.3.1.5 色谱条件

7.3.1.6 YES测定雌激素活性

7.3.1.7 β-半乳糖苷酶活性计算及EC50 计算方法

7.3.2 结果与讨论

7.3.2.1 葛根总提物酶解后雌激素活性与物质成分的变化

7.3.2.2 乙酸乙酯部位酶解后雌激素活性及物质成分的变化

7.3.2.3 正丁醇部位酶解后雌激素活性及物质成分的变化

7.4 选择离子监测（SIM）在分析葛根总提物的生物转化中的应用

7.4.1 实验部分

7.4.1.1 仪器与试剂

7.4.1.2 色谱条件

7.4.1.3 质谱条件

7.4.2 结果与讨论

7.4.2.1 葛根总提物酶解前后的质谱图比较

7.4.2.2 化合物9 和13 的生物转化

7.4.2.3 化合物17 的生物转化

7.4.2.4 化合物20 的生物转化

7.4.2.5 化合物26的生物转化

7.4.2.6 未发生生物转化的化合物

7.5 小结

参考文献

作者简介及发表文章

致谢

发布时间: 2007-03-13

参考文献

• [1].中药虎杖雌激素活性成分及其物质基础研究[D]. 张彩宁.中国科学院研究生院（大连化学物理研究所）2006

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