产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因的克隆、表达与功能鉴定

论文摘要

产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）是优良的甘油生产菌株,并且已成功的应用于工业生产中。研究者在产甘油假丝酵母菌株的生理生化、发酵工艺优化、代谢机理方面开展了卓有成效的研究。但是与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等模式菌株相比,该工业菌株的遗传和分子生物学信息比较匮乏。在C. glycerinogenes中,甘油合成途径的关键酶—胞浆3-磷酸甘油脱氢酶的编码基因以及该基因在细胞中的具体的生理功能是未知的。为此,本文从产甘油假丝酵母基因组中克隆出甘油合成的关键酶基因,并对其进行了详细的功能鉴定,最后通过在C. glycerinogenes过表达和缺失研究进一步确定该基因在细胞过量合成甘油中的作用。本文主要研究成果概括如下:（1）利用PCR方法,克隆了C. glycerinogenes的胞浆NAD+依赖的3-磷酸甘油脱氢酶编码基因（CgGPD）。1167 nt的开放阅读框编码一个分子量为43 kDa,包含388个氨基酸的蛋白,氨基酸水平上该基因与具有安格斯毕赤酵母相似性最高,为70.9%,与粟酒裂殖酵母相对较低,仅为46.7%。并且发现在产甘油假丝酵母基因组中仅有一个CgGPD基因,不存第二个同功异构酶编码基因。（2） CgGPD基因在gpd1/gpd2和gpd1酿酒酵母突变株中表达能够显著提高细胞耐渗透压能力和甘油合成能力,表明CgGPD基因能够完全功能互补酿酒酵母GPD1基因的缺失。渗透压诱导实验表明CgGPD基因的表达受到渗透压的生理调控。在野生型酿酒酵母中过量表达CgGPD基因能够大幅度提高细胞的甘油合成能力,同时结果表明CgGPD基因自身上游调控序列能够有效调控基因表达。（3） CgGPD和GPD2基因能够提高hog1细胞的耐渗性,而GPD1基因的表达对突变株的耐高渗透压能力并没有显著提高;在pbs2突变株中分别过量表达CgGPD、GPD1和GPD2基因都能够提高转化子在高渗压条件下的生长性能;过量表达CgGPD和GPD1能够使gpd1/gpd2突变株降低对渗透压的敏感性,GPD2基因的表达则不具这种显著的这种功能;在hog1和pbs2突变株中分别过量表达CgGPD、GPD1和GPD2基因均能使转化子细胞在渗透压刺激下诱导胞内甘油合成和积累;GPD1基因的过量表达仅能一定程度上互补gpd1/gpd2突变株细胞在厌氧环境中GPD2基因的功能,而过量表达CgGPD基因则能够完全功能互补GPD2基因的缺失。（4）根据同源重组原理,以含有腐草霉素（Zeocin）抗性基因的pGAPZb质粒为基本构架,以CgURA3基因作为整合位点构建了用于转化产甘油假丝的酵母的整合载体;分别优化了物理参数和细胞生理参数对电转化效率的影响。结果表明,对数生长中期的细胞经DTT或LiAc预处理后在2×109个/mL的细胞浓度下加入200μg的线性整合载体,在1600V电压下,200Ω电阻、25μF电容进行电击,获得的转化效率可达到394个转化子/μg DNA。（5）以腐草霉素抗性基因作为选择标记,分别构建CgGPD基因敲除载体pUC-gpd-Zeoin和同源表达载体pGA-rDNA-CgGPD,导入产甘油假丝酵母细胞,获得稳定的缺失突变株和过表达转化子。甘油发酵实验表明CgGPD基因缺失显著降低了细胞的甘油合成能力,同时增加了细胞的产乙醇能力,而细胞的EMP代谢途径活力的降低导致细胞量显著下降,使得细胞在高浓度葡萄糖下的生长能力受损;过量表达CgGPD基因能够加速葡萄糖的消耗,缩短发酵周期,从而提高甘油的产率和得率,同时胞内副产物丙酮酸、乙酸和乳酸等有一定的提高,而乙醇的生成则受到抑制。

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摘要

Abstract

第一章绪论

1.1 甘油在细胞内的生理功能及用途

1.1.1 参与能量代谢和细胞的生物质的合成

1.1.2 渗透压调解作用

1.1.3 血糖症的感应器

1.1.4 甘油在治疗和疾病诊断中的作用

1.2 甘油的工业应用

1.3 酵母细胞中与甘油代谢相关的几个基础问题

1.3.1 MAPK 信号转导途径

1.3.2 甘油合成与MAPK 介导的HOG 途径

1.3.3 甘油合成与细胞厌氧条件下的氧化还原调节

1.4 酵母3-磷酸甘油脱氢酶在甘油合成中的功能

1.4.1 酵母细胞甘油代谢途径

1.4.2 GPD1 基因缺失或过量表达对酵母甘油合成能力的影响

+-3-磷酸甘油脱氢酶编码基因'>1.4.3 已克隆的酵母胞浆NAD⁺-3-磷酸甘油脱氢酶编码基因

1.5 耐高渗透压酵母法生产甘油研究进展

1.6 立题依据与研究内容

参考文献

第二章产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶编码基因（CgGPD）的克隆及序列分析

2.1 引言

2.2 材料与方法

2.2.1 菌株、质粒及其培养条件

2.2.2 试剂

2.2.3 主要仪器

2.2.4 C. glycerinogenes 基因组DNA 的提取

2.2.5 简并PCR

2.2.6 PCR 产物克隆

2.2.7 感受态细胞制备

2.2.8 质粒DNA 的提取与验证

2.2.9 基因组DNA 的酶切

2.2.10 酶切片段的环化

2.2.11 反向PCR

2.2.12 CgGPD 基因的序列测定与生物信息学分析

2.2.13 Southern Blot

2.2.14 核苷酸序列号

2.3 结果

2.3.1 简并引物PCR 扩增CgGPD 部分保守片断

2.3.2 反向PCR 扩增CgGPD 基因全长序列

2.3.3 CgGPD 基因的序列分析

2.3.4 CgGPD 基因的遗传密码分析

2.3.5 CgGPD 基因编码蛋白的亚细胞定位预测分析

2.3.6 CgGPD 基因的多序列比对及其遗传进化

2.3.7 Southern blot 分析产甘油假丝酵母的CgGPD 基因

2.4 讨论

2.5 本章小结

参考文献

第三章产甘油假丝酵母胞浆3-磷酸甘油脱氢酶基因（CgGPD）在酿酒酵母中的表达及功能分析

3.1 引言

3.2 材料与方法

3.2.1 菌株、质粒及其培养条件

3.2.2 试剂

3.2.3 主要仪器

3.2.4 PCR 产物的克隆

3.2.5 转化子质粒DNA 的小量提取

3.2.6 酵母基因组DNA 的提取

3.2.7 表达载体的构建

3.2.8 酿酒酵母的醋酸锂高效转化

3.2.9 细胞粗提液的制备

3.2.10 酶活的测定

3.2.11 甘油和葡萄糖的测定

3.2.12 生物量的测定

3.3 结果与讨论

3.3.1 酵母表达载的构建

3.3.2 CgGPD 基因在渗透压敏感突变株gpd1/gpd2 和gpd1 中表达

3.3.3 渗透压冲击下CgGPD 基因表达对酵母细胞活性的影响

3.3.4 CgGPD 基因受渗透压胁迫诱导表达

3.3.5 CgGPD 基因表达提高酵母的甘油合成能力

3.4 本章小结

参考文献

第四章胁迫条件下比较分析CgGPD、GPD1 和GPD2 基因表达

4.1 引言

4.2 材料与方法

4.2.1 菌株、质粒及其培养条件

4.2.2 试剂

4.2.3 主要仪器

4.2.4 PCR 产物的克隆

4.2.5 转化子质粒DNA 的小量提取

4.2.6 基因组DNA 的提取

4.2.7 表达载体的构建

4.2.8 酿酒酵母的醋酸锂高效转化

4.2.9 细胞粗提液的制备和酶活的测定

4.2.10 甘油和葡萄糖的测定

4.2.11 生物量的测定

4.3 结果与讨论

4.3.1 CgGPD、GPD1 和GPD2 基因编码蛋白序列及生物信息学比较

4.3.2 重组载体YEplac-GPD1 和YEplac-GPD2 酵母表达载的构建

4.3.3 CgGPD 基因在渗透压敏感突变株h091 和p652 中表达

4.3.4 比较分析过量表达CgGPD、GPD1 和GPD2 基因对突变株生长的影响.

4.3.5 CgGPD、GPD1 和GPD2 基因表达对突变株在渗透压胁迫下甘油合成能力的影响

4.3.6 厌氧培养条件下CgGPD、GPD1 和GPD2 基因表达对突变株的影响

4.4 本章小结

参考文献

第五章产甘油假丝酵母整合电击遗传转化

5.1 引言

5.2 材料与方法

5.2.1 菌株、质粒以及培养条件

5.2.2 试剂

5.2.3 主要仪器

5.2.4 分子生物学常规操作

5.2.5 整合载体的构建

5.2.6 产甘油假丝酵母的电击转化

5.2.7 醋酸锂转化

5.2.8 转化子的验证

5.3 结果

5.3.1 C. glycerinogenes 对腐草霉素（Zeocin）抗生素的敏感性

5.3.2 整合载体的构建

5.3.3 电场强度对转化效率的影响

5.3.4 DTT 和/或LiAc 预处理细胞提高C. glycerinogenes 转化效率

5.3.5 细胞的生长状态对转化效率的影响

5.3.6 细胞浓度和质粒量对转化效率的影响

5.3.7 电击后的细胞处理对转化效率的影响

5.3.8 转化子的验证

5.4 讨论

5.5 本章小结

参考文献

第六章 CgGPD 基因过表达或缺失对产甘油假丝酵母甘油合成能力的影响

6.1 引言

6.2 材料与方法

6.2.1 菌株、质粒及其培养条件

6.2.2 试剂

6.2.3 主要仪器

6.2.4 PCR 产物的克隆

6.2.5 转化子质粒DNA 的小量提取

6.2.6 基因组DNA 的提取

6.2.7 CgGPD 基因敲除载体和过表达载体的构建

6.2.8 产甘油假丝酵母的电击转化

6.2.9 细胞粗提液的制备和酶活的测定

6.2.10 分析方法

6.3 结果与讨论

6.3.1 CgGPD 基因敲除载体pUC-gpd-Zeocin 的构建

6.3.2 CgGPD 基因过表达载体pGA-rDNA-CgGPD 的构建

6.3.3 产甘油假丝酵母CgGPD 基因中断突变株和过表达转化子的鉴定及遗传稳定性

6.3.4 CgGPD 基因中断或过量表达对细胞生长的影响

6.3.5 CgGPD 基因中断或过量表达对葡萄糖消耗的影响

6.3.6 CgGPD 基因中断或过量表达对细胞甘油合成能力的影响

6.3.7 CgGPD 基因中断或过量表达对相关代谢副产物的影响

6.3.8 CgGPD 基因中断或过量表达转化子在发酵过程中GPD 酶活的变化

6.4 本章小结

参考文献

主要结论

论文创新点

致谢

附录：作者在攻读博士学位期间发表的论文

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