脱毛蛋白酶产生菌的选育及其碱性蛋白酶基因的克隆与表达

论文摘要

皮革工业在创造巨大经济价值的时候，也给环境带来了严重的危害。制革污染主要来自于灰碱法脱毛过程，采用蛋白酶进行酶法脱毛是从根本上解决制革工业严重污染的有效途径。本论文进行了脱毛蛋白酶产生菌的分离、碱性蛋白酶基因的克隆及表达、蛋白酶基因的定向进化等方面的研究工作。针对用于生皮脱毛这一特定目的，以脱毛效果和质量作为标准，进行了脱毛蛋白酶产生菌的筛选。从多个富含蛋白质的土壤样品中筛选获得6株胞外蛋白酶活力在500 U／mL以上的细菌。用这6株菌的发酵液进行的生皮脱毛实验表明，菌株BA06产生的蛋白酶具有最好的脱毛质量，脱毛后皮的胶原结构保持完整。通过形态观察、生理生化性质分析和16S rDNA序列比较，该菌株被鉴定为短小芽孢杆菌（Bacillus pumilus）。短小芽孢杆菌BA06只分泌一种胞外碱性蛋白酶，分子量约30 kDa。为了进一步提高菌株的蛋白酶产量，采用紫外线、亚硝基胍、加热及Co60辐照等方法对BA06进行复合诱变，获得了蛋白酶活力大幅度提高的突变菌株UN-31-C-42和SCU11，在最佳摇瓶发酵条件下，其胞外的碱性蛋白酶活力分别为4，200 U／mL和6，000 U／mL。上述3个菌株的碱性蛋白酶基因序列分析表明，3个基因的核苷酸序列是完全相同的。利用PCR从短小芽孢杆菌UN-31-C-42菌株中扩增到碱性蛋白酶基因，进行了蛋白酶基因在大肠杆菌和芽孢杆菌的表达研究。在大肠杆菌中表达的蛋白酶主要以包涵体形式存在，采用不同方法进行复性均无法得到有活性的碱性蛋白酶。利用短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因自身的启动子Papr和枯草芽孢杆菌P43启动子，构建了适合于芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因表达质粒pSUBpWAp和pP43AP。将表达质粒转入枯草芽孢杆菌WB600菌株，均可表达产生有活性的碱性蛋白酶。把表达质粒pSUBpWAp转入短小芽孢杆菌UN-31-C-42，发现质粒可以在宿主细胞内稳定存在，但宿主菌的蛋白酶基因表达水平并未得到提高。表达质粒pSUBpWAp在枯草芽孢杆菌WB600中的稳定性研究结果表明，转化菌株在培养过程中出现了严重的质粒缺失现象。这种结构型的质粒不稳定性与Papr启动子启动的蛋白酶基因在宿主细胞的高效表达有关，还与宿主菌的特性有显著关系。为了进行碱性蛋白酶基因定向进化研究，需要在枯草芽孢杆菌中建立大规模基因突变文库，因此对枯草杆菌感受态转化方法进行了优化。首先比较了4个大肠杆菌菌株BL21（DE3），DH5α，JM109和Top10产生质粒多聚体的能力，发现BL21（DE3）和DH5α菌株能形成较高比例的质粒多聚体，从DH5α菌株中提取的质粒，比从JM109和Top10中所提取质粒的转化效率至少高10倍。转化过程的优化实验发现，DNA与感受态细胞共培养时间及转化后细胞的恢复培养对转化效率具有显著影响。通过对各种条件的改进，建立了一种高效快速且十分简单的枯草杆菌感受态转化方法，转化效率最高达到6×104／μg DNA。利用本方法，可以在1d时间内建立有数十万个转化子的枯草芽孢杆菌文库。本方法也可用于枯草芽孢杆菌不同菌株或其它芽孢杆菌的转化。采用易错PCR方法对碱性蛋白酶基因编码区和终止子片段进行随机突变。首先在大肠杆菌中建立蛋白酶基因的随机突变库，然后转化枯草芽孢杆菌WB600，通过菌落在牛奶平板上产生的水解圈大小及发酵液的酶活测定筛选蛋白酶活力提高的阳性克隆。通过2轮的突变和筛选，得到一个突变体pSUBpMAp-37，它在牛奶平板上产生的水解圈远远大于野生型对照，但胞外蛋白酶活力却明显低于对照。MAp-37突变基因片段的序列分析表明，该片段共发生了16个碱基突变，其中前肽编码区4个，成熟肽编码区8个，终止子区4个。突变导致4个氨基酸的变化，2个位于前肽，2个位于成熟肽。初步的实验结果表明，MAp-37片段中成熟肽编码区的突变可能对成熟蛋白酶的催化性质没有明显影响，突变基因表达特性可能是各突变区域共同作用的结果。

论文目录

• 正文目录
• 图形目录
• 表格目录
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 脱毛蛋白酶产生菌的选育及其碱性蛋白酶基因的克隆
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果
• 3.1 脱毛蛋白酶产生菌的分离
• 3.2 脱毛蛋白酶产生菌BA06的鉴定
• 3.3 短小芽孢杆菌BA06胞外蛋白酶的性质研究
• 3.4 短小芽孢杆菌BA06的诱变及筛选
• 3.5 短小芽孢杆菌UN-31-C-42碱性蛋白酶完整基因的克隆
• 3.6 短小芽孢杆菌不同突变菌株碱性蛋白酶基因的序列比较
• 4 讨论
• 4.1 脱毛蛋白酶产生菌的筛选
• 4.2 短小芽孢杆菌BA06的诱变育种
• 4.3 短小芽孢杆菌的碱性蛋白酶基因
• 参考文献
• 第二章 枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）高效转化方法的建立
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果
• 3.1 不同大肠杆菌菌株产生质粒多聚体的比较
• 3.2 枯草芽孢杆菌WB600感受态细胞的制备
• 3.3 质粒DNA与感受态细胞共培养过程对转化效率的影响
• 3.4 恢复培养时间对转化效率的影响
• 3.5 枯草芽孢杆菌WB600高效快速的转化方法
• 3.6 其它芽孢杆菌的转化
• 4 讨论
• 4.1 枯草芽孢杆菌的转化方法
• 4.2 质粒多聚体与枯草芽孢杆菌感受态转化
• 4.3 本转化方法的特点
• 参考文献
• 第三章 短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的表达研究
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果
• 3.1 碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达
• 3.2 碱性蛋白酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达
• 3.3 碱性蛋白酶基因在短小芽孢杆菌中的表达
• 3.4 碱性蛋白酶基因表达质粒在芽孢杆菌中的稳定性研究
• 3.5 碱性蛋白酶基因启动子的功能研究
• 4 讨论
• 4.1 短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因在大肠杆菌中的表达
• 4.2 用于枯草芽孢杆菌基因表达的启动子
• 4.3 枯草芽孢杆菌中的质粒不稳定性
• 4.4 提高外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达水平
• 参考文献
• 第四章 短小芽孢杆菌碱性蛋白酶基因的定向进化研究
• 摘要
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 实验方法
• 3 结果
• 3.1 蛋白酶基因定向进化策略
• 3.2 蛋白酶基因编码区的随机突变
• 3.3 碱性蛋白酶基因随机突变库的建立及突变体的筛选
• 3.4 碱性蛋白酶基因突变体的鉴定
• 4 讨论
• 4.1 枯草杆菌蛋白酶的蛋白质工程
• 4.2 定向进化研究中的主要影响因素
• 4.3 突变体pSUBpMAp-37的性质
• 参考文献
• 文献综述 细菌碱性蛋白酶的研究及工业应用
• 摘要
• 1 细菌碱性蛋白酶产生菌
• 2 蛋白酶产生菌的选育
• 3 蛋白酶的发酵工艺
• 4 碱性蛋白酶基因的克隆和过量表达
• 5 碱性蛋白酶的特性及晶体结构
• 5.1 pH及温度
• 5.2 稳定剂及金属离子的影响
• 5.3 底物特异性
• 5.4 动力学参数
• 5.5 晶体结构
• 6 蛋白质工程
• 6.1 改变底物特异性与酶活性
• 6.2 提高酶的稳定性
• 6.3 提高有机相中的蛋白酶活性
• 7 酶的定向进化
• 8 碱性蛋白酶的前肽工程
• 9 发现新蛋白酶——土壤宏基因组（metagenome）的克隆
• 10 碱性蛋白酶的应用
• 10.1 食品和饲料工业
• 10.2 肽链合成
• 10.3 皮革工业
• 10.4 工业和生活废物的处理
• 10.5 照片工业
• 10.6 医学应用
• 10.7 丝绸脱胶
• 10.8 在去污工业中的应用
• 11 前景
• 参考文献
• 在读期间发表及待发表的论文
• 致谢