论文摘要
尽管机体内具有一系列的免疫监视,但仍难以阻止肿瘤的发生和发展,因为肿瘤细胞有多种机制可以逃避人体免疫系统监视,如肿瘤表面抗原缺失,致使免疫细胞不能识别肿瘤细胞,还可以产生多种免疫抑制因子以降低宿主免疫力等。特别是老年患者,随着衰老和免疫抵抗力的下降,肿瘤细胞更易逃避免疫的监视从而导致肿瘤的发生。新近研究证实,Fas、FasL以膜结合蛋白或可溶性分子两种形式存在,与其信号传导途径中的许多细胞内外因子共同组成Fas/FasL系统,在维持组织正常发育,控制免疫反应和调节机体生理平衡中起重要作用,并参与机体细胞免疫,与肿瘤的发生发展密切相关。Fas和FasL相结合是Fas在体内发挥作用的唯一途径。近来研究表明,一些非淋巴系肿瘤细胞也表达FasL。在人结肠、胃、胰腺等部位的恶性肿瘤细胞,均发现有FasL的表达。因此,肿瘤细胞可能通过自身表面的FasL与激活的T淋巴细胞表面的Fas结合,诱导T细胞发生凋亡,逃避免疫系统的监视。为探讨非小细胞肺癌反杀伤T淋巴细胞的可能机制,本实验按如下三个部份进行研究。第一部分通过siRNA靶点序列设计软件结合Angela siRNA设计原则,设计、合成Fas/FasL特异性siRNA靶点序列;再将靶点序列插入pGCsi-U6质粒构建siRNA质粒;通过免疫印迹的方法检测转染siRNA质粒后人A549肺癌细胞株中Fas/FasL的表达水平,从而确定干扰效果最佳的质粒。分别将确定的Fas/FasL siRNA质粒转染A549细胞,用800μg/ml浓度G418进行筛选培养,挑选细胞克隆,继续传代培养。并选取生长最好的两个克隆的细胞,再次进行Western Blot筛选,最后挑选干扰效果最好的A549细胞来进行下一步实验。第二部分将Fas/FasL特异性小干扰RNA质粒和无关对照质粒psiNEGative RNAi转染肺腺癌A549细胞,Western Blot、RT-PCR检测Fas/FasL siRNA质粒转染后（即Fas/FasL基因静默后）,上述A549细胞中Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8分别在基因和蛋白水平的表达;同时采用MTT和流式细胞仪方法,检测各组细胞在细胞活力以及凋亡的改变,探讨肿瘤自身表达的Fas/FasL对其自身活性的影响,即肿瘤是否可通过自身表达的Fas/FasL引起自杀。另外由于T细胞可以通过自分泌方式凋亡,即T细胞自身表达的Fas/FasL可以引起T细胞自身凋亡,因此用抗FasL抗体（NOK-1）封闭细胞本身的FasL表达,利用MTT和流式细胞仪方法,检测封闭FasL表达与否细胞活力及凋亡的改变。第三部分首先采用胶原酶原代培养人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）,传代培养后用免疫组织化学的方法,用VIII因子相关抗原鉴定,同时用免疫组织化学方法检测HUVEC细胞Fas表达的情况;另外利用Jurkat细胞来作为活化的T淋巴细胞,将A549转染pSi-FasL、A549转染psiNEGative RNAi两组细胞分别与HUVEC和Jurkat细胞混合培养,同时分别用流式细胞仪检测不同效靶比、NOK-1封闭FasL表达与否,HUVEC和Jurkat细胞凋亡的情况。实验的主要结果如下:1.各组siRNA质粒干扰效率存在差异。Western Blot结果证实在Fas-siRNA的设计中pSi-Fas1的DNA序列遵循了其中Angela六条原则,而其它两个DNA序列则遵循了Angela五条原则,pSi-Fas1干扰效果最好;FasL-siRNA的设计中pSi-FasL2的DNA序列遵循了其中Angela六条原则,而其它两个DNA序列则遵循了Angela五条原则,pSi-FasL2干扰效果最好。将pSi-Fas1、pSi-FasL2转染A549细胞后即得到Fas/FasL被特异性基因静默的肺腺癌细胞株。2.亲代A549细胞在基因和蛋白水平均低表达Fas、Caspase-3、Caspase-8,高表达FasL;A549细胞转染pSi-Fas后在基因和蛋白水平均低表达Fas、Caspase-3、Caspase-8,高表达FasL;A549细胞转染pSi-FasL后在基因和蛋白水平均低表达Fas、FasL、Caspase-3、Caspase-8;A549转染psiNEGative RNAi后在基因和蛋白水平均低表达Fas、Caspase-3、Caspase-8,高表达FasL。MTT和流式细胞仪结果显示三组细胞在细胞活力和凋亡方面没有变化。3. MTT和流式细胞仪结果显示亲代A549细胞和A549转染psiNEGative RNAi在是否NOK-1封闭FasL表达,其细胞活力及凋亡均无改变;而Jurkat细胞在没有封闭FasL表达时出现细胞活力降低,细胞凋亡明显增加,NOK-1封闭FasL表达后Jurkat细胞活力和凋亡处于正常水平。4.成功原代培养了人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）,传代培养后用免疫组织化学的方法,经VIII因子相关抗原鉴定证实为HUVEC,同时免疫组织化学方法证实HUVEC细胞不表达Fas。5.将A549转染pSi-FasL、A549转染psiNEGative RNAi两组细胞分别与HUVEC和Jurkat细胞混合培养,同时用流式细胞仪（Annexin+PI法）检测发现:转染psiNEGative RNAi组的Jurkat细胞出现凋亡,各组凋亡率随着效/靶比增加而增加（1:30>1:10>1:3）,而转染FasL siRNA质粒组的Jurkat细胞未出现凋亡,其凋亡与效/靶比无关;HUVEC与A549转染pSi-FasL、A549转染psiNEGative RNAi两组细胞共培养后在不同效靶比下均未发现HUVEC凋亡增加。6.在用抗FasL抗体（NOK-1）封闭A549细胞和A549细胞转染psiNEGative RNAi组FasL表达后,上述两种细胞分别与HUVEC和Jurkat细胞混合培养,同时用流式细胞仪（Annexin+PI法）检测检测不同效靶比发现:A549细胞组、转染psiNEGative RNAi组的Jurkat细胞和HUVEC均未出现凋亡,并且与效/靶比无关。综合以上研究结果,可以得到以下结论:1.在筛选siRNA靶位点时可参照Angela标准以提高干扰效率。而Western Blot方法可被广泛应用于筛选siRNA重组质粒。2. A549细胞的Fas/FasL凋亡动态信息链在没有外界刺激下处于非激活状态,因此非小细胞肺癌细胞不能通过自身表达的Fas/FasL引起自身的凋亡。3. T细胞自身表达的Fas/FasL可以引起T细胞自身凋亡,封闭T细胞的FasL表达后T细胞凋亡现象消失。4.人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）不表达Fas,因此肺癌细胞不能通过Fas/FasL途径杀伤HUVEC,肺癌细胞突破血管基底膜屏障不是通过Fas/FasL途径来完成的。5.肺腺癌A549可以反杀伤T淋巴细胞,这种反杀伤效应是通过Fas/FasL途径进行的。6.本研究对非小细胞肺癌反杀伤T淋巴细胞作了初步探讨,为进一步完善并建立肿瘤特异性CTL细胞模型提供依据并为研究肿瘤免疫逃避、免疫耐受等生物学行为奠定基础。