论文摘要
受体来源未成熟树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫低反应性的实验研究肝移植是治疗终末期肝病的有效方法,肝脏是移植“免疫特惠”器官,移植后排斥反应虽然没有其他器官（如心、肺、胰和肾等）严重,但移植肝的排斥问题,仍然是目前有待解决的一大难题,目前虽然许多新型免疫抑制药物的应用使排斥反应发生率有了明显下降,但是免疫抑制剂的长期乃至终生应用,除了经济负担之外,过度免疫抑制、病毒感染以及恶性肿瘤等也给移植患者带来了十分不利的影响。因此,人们在致力于寻找另一种有效的方法,使移植器官能在不应用免疫抑制剂的情况下长期、有功能的存活。其中未成熟树突状细胞（immaturedendritic cells,imDC）诱导免疫耐受或免疫低反应被普遍认为是一种有效的方法。由于imDC独特的调节免疫细胞的生物学特性,使其越来越为移植领域所重视,同种异体肝移植中,imDC通过阻断抗原递呈、使T细胞不能活化达到诱导免疫低反应甚至免疫耐受,避免或减轻排斥反应,延长移植物存活的目的。目前正在进行的实验研究中几乎均是使用供体来源的imDC通过直接识别途径诱导肝移植免疫耐受及免疫低反应,但来源于供体的imDC需要在移植前数天进行体外培养获得并与受体移植术前7-10d注射,这对于临床尸体供肝的肝移植几乎是无法操作的,而且这些供体来源的imDC会因为宿主体内的同种异体反应被清除,使已经产生的免疫耐受或免疫低反应作用消失。而使用受体来源的imDC则可避免以上不利因素,因此运用受体来源imDC阻断间接识别途径诱导肝移植免疫低反应甚至耐受可能会成为行之有效方法。本试验拟从以下三方面研究受体来源imDC诱导大鼠肝移植免疫低反应性:1、建立稳定的大鼠原位肝移植急性排斥反应模型:2、受体大鼠未成熟树突状细胞体外扩增、鉴定及功能特性的研究,观察其体外对同种异体T细胞增殖的抑制作用3、在前两方面研究的基础上进一步研究不负载供体抗原的受体来源imDC诱导大鼠肝移植免疫低反应性。阐明其诱导大鼠肝移植免疫低反应性的机理。第一部分大鼠原位肝移植急性排斥反应模型的建立目的:建立稳定的大鼠原位肝移植的急性排斥反应模型并观察其急性排斥反应的特点。为进一步的实验研究搭建坚实的技术平台。方法:1采用改良“二袖套管法”,利用封闭群SD大鼠进行大鼠肝移植模型技能训练。2对照研究SD-Wistar,Wistar-Wistar配对组合的肝移植后排斥反应,分别观察术后第4d、7d、10d天症状、体征、肝功能变化、移植肝病理特征等的变化,并对肝移植急性排斥反应模型制备作出客观评价,每组另5只观察生存时间。结果:1技能练习阶段受体大鼠的存活时间大多不超过72小时。此时段主要为手术操作技能的训练、围手术期管理积累经验。2正式实验中两组术后血清ALT同期比较Wistar-Wistar组明显低于SD-Wistar组（P＜0.01）差异有显著性,SD-Wistar组随着术后时间延长ALT呈进行性的升高（P＜0.01）,而Wistar-Wistar组ALT逐渐下降,组内比较差异无显著性。3正式实验中两组术后血清TBIL第7d、10d两组比较Wistar-Wistar组明显低于SD-Wistar组（P＜0.01）差异有显著性;随着术后时间延长TBIL呈进行性的升高（P＜0.01）,而Wistar-Wistar组TBIL无明显升高,组内比较差异无显著性。4正式实验中术后7d、10d,SD-Wistar组移植肝脏病理可见汇管区三体（肝动脉、门静脉和胆管汇管）炎细胞浸润大量淋巴细胞浸润,肝小叶结构破坏明显,肝细胞呈灶块状坏死,肝实质内散在一些淋巴、单核、中性粒细胞浸润。少数汇管区内有小胆管破坏。Banff评分Ⅱ-Ⅲ级。而Wistar-Wistar组,肝脏病理可见汇管区三体（肝动脉、门静脉和胆管汇管）少量淋巴细胞浸润,浸润程度未达到急性排斥的诊断标准,Banff评分0级。结论:1大鼠原位肝移植模型制作难度较大,影响因素众多。熟练的显微外科技术,完善的围手术期处理及耐心细致的操作是决定手术成功的关键。2 SD-Wistar组大鼠肝移植出现明显、稳定的排斥反应的特征,可作为ROLT急性排斥模型进行相关的研究。第二部分大鼠未成熟树突状细胞体外分离、培养及功能特性的研究目的:采用抑制性细胞因子白介素-10（IL-10）体外抑制树突状细胞成熟过程,探讨大鼠未成熟树突状细胞（Immature Dendritic cells,imDC）分离、培养、鉴定的方法,为进一步使用imDC诱导大鼠异体肝移植免疫低反应提供理论依据和治疗手段。方法:1大鼠骨髓细胞的制备:无菌取大鼠胫骨和股骨骨髓,Tris-NH4Cl溶液使红细胞充分溶解。离心后重复洗涤3次。收集沉淀的骨髓细胞。调整细胞浓度为1×106/ml备用。2未成熟树突状细胞的培养:含10%FCS的完全RPMI1640重悬细胞并调整细胞数至1×106ml,置于1%明胶包板的6孔板中。37℃、5%CO2培养箱4h,弃上清,用37℃的RPMI1640轻轻洗去非贴壁细胞。贴壁细胞每孔加入含rrGM-CSF（20ng/ml）、rrIL-4（10ng/ml）的RPMI1640培养基调整细胞浓2ml,37℃、5%CO2培养.培养至第5d,按加入细胞因子不同分为两组:IL-4组,继续在原培养基中培养;IL-10组,上述培养基中加入IL-10（10ng/ml）,培养至第9d,收集细胞。3显微镜观察:每天用倒置显微镜观察、摄片。4扫描电镜观察:与培养第8d将无菌玻片放入培养孔中过夜,第9d收集细胞描电镜观察,5树突状细胞纯度和表型分析:分别收集不同培养条件下树突状细胞,加入PE或FITC标记的抗大鼠CD80、CD86、MHC-Ⅱ、OX62单克隆抗体,流式细胞仪进行表型分析。6混合淋巴细胞反应:分别收集不同培养条件下Wister大鼠树突状细胞,灭活增殖性,作为刺激细胞。取正常Wister大鼠脾脏,尼龙毛吸附法制备纯化T细胞,作为反应细胞。刺激细胞与反应细胞按1:5、1:10、1:20、1:40混合培养,采用MTT法,酶联免疫检测仪测定490nm OD值。7调节性T细胞（CD4+CD25+T细胞）的检测:将DC与T细胞以10:1比例混合培养加入FITC-CD4单克隆抗体和PE-CD25单克隆抗体,流式细胞仪进行检测8树突状细胞培养上清IL-12水平检测:在树突状细胞培养不同时间分别收集IL-4组和IL-10组半量换液之离心上清,IL-12检测采用抗体夹心ELISA法。结果:1不同细胞因子刺激下和不同培养时间树突状细胞的生长情况和形态:大鼠树突状细胞呈现半悬浮生长状态。培养至第3d,可见部分细胞附壁生长,在第5d出现毛刺状细胞,随着培养时间的延长,IL-4组此类细胞数量增多,毛刺状突起更加明显,并逐渐脱壁;至第9d,可以观察到形态均一、毛刺状聚集成簇的成熟树突状细胞;IL-10组树突状细胞毛刺状和聚集体不明显,仍停留在未成熟状态。2树突状细胞表型分析:IL-4组及IL-10组树突状细胞在培养结束时表面表达OX62（大鼠树突状细胞表面标志）的细胞比率分别为89.46±5.94%和88.60±4.22%,两组比较,无明显差异（P＞0.05）,说明利用IL-10不影响树突状细胞分化与扩增,可以获得较高纯度的未成熟树突状细胞。IL-4组共刺激分子CD80和CD86表达水平分别为88.18±5.72%和81.98±6.30%,MHC-Ⅱ类分子表达水平为83.46±6.32%;IL-10组树突状细胞表面CD80和CD86表达水平分别为20.59±3.21%和19.89±2.48%MHC-Ⅱ类分子表达水平为19.62±2.30%;两组比较,差异具有显著性（P＜0.01）,说明IL-10能够抑制树突状细胞的成熟过程,阻断其表面共刺激分子和MHC-Ⅱ类分子上调表达,降低其抗原提呈能力。3混合淋巴细胞反应中,刺激细胞与反应细胞按1:5、1:10、1:20和1:40共同培养,IL-4组树突状细胞刺激同种异体T细胞的增殖反应强度（OD值）分别为:0.669±0.251、1.144±0.125、1.547±0.136、1.944±0.112;IL-10组树突状细胞刺激同种异体T细胞的增殖反应强度（OD值）分别为0.304±0.052、0.52±0.084、0.624±0.078。两组比较,差别具有显著性（P＜0.05）,说明IL-10组树突状细胞对同种异体T细胞的刺激能力低下,本实验培养的imDC在体外有诱导免疫低反应的作用。4未经DC刺激的T细胞CD4+CD25+Tre细胞的比例很低,约为1.91±0.24%。经imDC、mDC刺激后CD4+CD25+Tre细胞的比例较刺激均有所升高,但imDC刺激后升高的幅度较mDC组明显升高（P＜0.05）。5树突状细胞培养上清IL-12水平检测IL-4组树突状细胞培养7d以后,上清中IL-12水平明显增高,而IL-10组树突状细胞培养上清IL-12水平增高不明显,与同期IL-4组比较,明显处于低状态,差异具有显著性（P＜0.05）。结论:1利用IL-10在体外能够抑制大鼠树突状细胞的成熟,而不影响骨髓前体细胞向树突状细胞的分化。2本实验从形态学、特异性表面标志OX62、共刺激分子、功能活性等方面进行全面鉴定,证实了分离、培养体系的正确性。3利用IL-10诱导imDC扩增方法简单、可靠、高效。第三部分受体来源未成熟树突状细胞诱导大鼠肝移植免疫低反应性的机理研究目的:在建立稳定的大鼠肝移植急性排斥模型及imDC体外扩增、鉴定的基础上,采用不负载供者抗原的受者imDC阻断间接识别途,诱导受体产生免疫低反应,观察其对于异基因大鼠肝移植的保护作用,探讨imDC抑制排斥反应的机理。方法:1以SD大鼠作为供体,Wistar大鼠作为受体的大鼠肝移植急性排斥反应模型建立,见第一部分。2受体（Wistar大鼠）来源的未成熟树突状细胞的获取、鉴定,见第二部分。3实验分组将实验动物随机分为4组,每组25只,进行不同的预处理:（1）对照组（A组）:受体均为wistar大鼠未接受任何预处理。（2）环孢素组（B组）:受体均为wistar大鼠,术后第2d开始给予环孢素A处理,10mg/kg.只每天一次。（3）成熟树突状细胞组（C组）:术前ld经阴茎背静脉注射wiatar大鼠来源的成熟树突状细胞1×106/只;次日行供体为SD大鼠,受体均为wistar大鼠两袖套原位肝移植。（4）未成熟树突状细胞组（D组）:术前1d经阴茎背静脉注射wiatar大鼠来源的未成熟树突状细胞1×106/只;次日行供体为SD大鼠,受体均为wistar大鼠两袖套原位肝移植。4移植大鼠生存状态观察和移植排斥反应的判断:大鼠在异基因肝移植手术后3d内死亡,认为死亡与手术并发症和感染有关,弃之不用。并给与补充,观察每组的生存时间,根据Banff评分系统判断排斥反应程度。5流式细胞仪检测CD4+CD25+Tre细胞:分别在肝移植术后3d、5d、7d、10d,收集血标本,送流式细胞检测。6血清生化指标测定:分别在肝移植术后3d、5d、7d、10d,收集血清全自动生化分析仪测定ALT、AST、TBIL,双抗体夹心ELISA法检测血清IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平。7移植肝脏组织学检查:HE染色、免疫组化（FasL/Fas）,观察肝脏织形态结构和排斥反应。8 Western蛋白印迹分析:检测各组Foxp3编码的Scurfin蛋白的表达。结果:1 B、D组术后生存中位时间明显长于A、C组,差异有显著性（P＜0.05）。2移植术后各组大鼠血清生化检查:在移植术后3、5、7、10肝功能B、D组。逐渐恢复,A、C组ALT、AST、TBIL急剧上升,与存活时间表现一致。A、C组IL-2、IFN-γ明显高于B、D组（P＜0.01）,而IL-4、IL-10明显低于B、D组（P＜0.01）。3外周血CD4+CD25+Tre流式细胞检测:D组CD4+CD25+Tre 7d、10d明显高于其他3组,差异有显著性（P＜0.05）。4移植肝脏形态学检测:A、C组与B、D组同期比较排斥反应明显严重（P＜0.05）5 Western蛋白印迹分析检测:D组10d Foxp3编码的Scurfin蛋白的表达明显高于其他3组,结果与CD4+CD25+Tre流式细胞检测一致。结论:1间接识别在急性排斥作用中也起着重要的作用,通过阻断该途径能明显延长移植物存活时间。2 imDC可能通过以下机理诱导免疫低反应:（1）诱导T细胞凋亡。（2）诱导T细胞无能或低能反应。（3）诱导免疫偏移,选择性激活Th2细胞亚群。（4）诱导调节性T细胞产生。
论文目录
相关论文文献
标签：大鼠论文; 肝移植论文; 两袖套法论文; 排斥反应论文; 未成熟树突状细胞论文; 白介素论文; 共刺激分子论文; 免疫低反应论文;