论文摘要
研究背景骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是一种全身性的骨骼疾病，主要表现为骨组织内单位体积中骨量减少，骨矿物质和骨基质随年龄的增加（或妇女绝经后）等比例的减少，骨组织的显微结构发生改变而致其骨组织的正常荷载功能发生变化。OP的发病机制主要是由成骨细胞（Osteoblast，OB）的骨形成功能不足和破骨细胞（Osteoclast，OC）的骨吸收亢进所导致的，最终导致骨重建平衡被破坏。OP发病中OB与OC两种细胞是相互联系和相互影响的。其中OB所分泌的两种细胞因子骨保护素和护骨素配体在OP发病机制中发挥重要的作用。骨保护素（osteoprotegerin，OPG）是OB表达的可溶性肿瘤坏死因子受体超家族中的成员；护骨素配体，又称细胞核因子—κB受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）是一种Ⅱ型跨膜蛋白，是OC分化所必需的细胞因子，具有诱导OC生成作用。OPG能特异性地与可溶性RANKL结合，从而抑制OC生成、分化和成熟，抑制骨破坏。同时，OPG对TNF-α诱导的成骨细胞凋亡有抑制作用。因此，OPG和RANKL在OC分化、活化过程中占重要地位，参与了骨破坏的基本过程。OB的生长、分化主要由以丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）细胞信号转导通路介导，因此，MAPK通路是骨质疏松症发生过程中重要细胞信号转导途径。研究证明MAPK通路中：（1）ERK通路主要是转导启动OB分化所需的信号；（2）JNK通路主要是诱导前列腺素E和血管内皮生长因子，来促进OB分化；（3）p38通路主要介导OPG和／或RANKL的表达，介导OC的生长与凋亡。经临床实验与研究，在OP的预防与治疗中，中医中药治疗有其优势之处。我们课题组根据骨质疏松症在中医辩证中“肾虚血瘀、脾失健运”的病理特点，研制了具有补肾壮骨、活血通络之功的治疗骨质疏松症药物——骨灵丸。骨灵片是在骨灵丸的基础上，通过剂型改革研制的。前期的骨质疏松大鼠模型实验以及大鼠OB／OC共育体系实验等研究显示骨灵片（丸）（Gu Ling Pian，GLP）能有效防治OP，改善OP大鼠模型以及大鼠OB／OC共育体系的各项指标。研究目的1．观察GLP对体外培养的人OB的细胞增殖率、矿化结节数、OPG／RANKL表达的影响；2．探讨含GLP对p38 MAPK信号通路的调控作用，进一步从分子信号转导机制探讨GLP的作用机理，为GLP治疗OP提供理论和实验依据。方法1．取人髂骨松质骨，采用改良胰酶—胶原酶消化法分离培养人OB；从细胞的形态学、特异性酶染色及免疫组化技术等方面鉴定培养的OB；2．实验分组：实验一分四组：GLP高剂量组（high doses，HD）、GLP中剂量组（middle doses，MD）、GLP低剂量组（low doses，LD）、空白血清对照组（Control）；实验二中加入为研究GLP对p38MAPK通路的调控作用，我们采用了p38特异性抑制剂SB203580进行干预，并分四组：SB组（只加入SB203580组）、SB+HD组（加入SB203580和高剂量GLP组）、HD组（只加入高剂量GLP组）、空白血清对照组（Control）；3．应用四唑盐比色法（MTT）及茜素红染色法分析GLP对OB的增殖及矿化功能的影响；4．使用real time PCR、Western-blot等技术检测各实验组中的OPG和RANKL基因表达以及p38蛋白的变化；5．统计分析：所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析，结果表示为：均数士标准差（（?）±S），方差齐时，两组比较采用LSD，如多组与对照组比较使用Dunnett检验，当方差不齐时，采用Welch稳健估计，再采用T2方法两两比较。P＜0.05表示有统计学意义。结果1．经不同浓度含GLP药液血清作用的单独培养的OB各指标变化如下：（1）细胞增殖率：各组细胞增殖率的总体比较具有显著性差异（F=24.211P＜0.001）。HD组、MD组、LD组与空白对照组细胞增殖率分别是（152.06±14.35）、（143.42±8.46）、（118.96±15.68）和（100.32±14.46）：高剂量组、中剂量组与空白对照组比较，具有显著性差异（P＜0.05）；高、中剂量组之间比较无显著性差异（P＞0.05）。结果提示GLP可促进OB的增殖。（2）矿化结节数：各组矿化结节数的总体比较具有显著性差异（F=315.247P＜0.001）。HD组、MD组、LD组与空白对照组的矿化结节的数量（个）分别是（201.60±11.25）、（181.10±6.76）、（118.02±8.97）和（86.97±6.17）LD组、HD组、MD组与空白对照组比较升高具有统计学意义（P＜0.01）；高、中剂量组之间差异无显著性（P＞0.05）。（3）real time PCR测定OPG和RANKL的基因表达：各组OPG mRNA表达的总体比较具有显著性差异（F=100.971 P＜0.001），L组、M组、H组的OPG mRNA呈现高表达水平，分别为（1.8±0.19）、（3.61±0.5）、（4.14±0.51），与空白对照组（1.01±0.14）比较，M组和H组结果有显著性差异（P＜0.01）；各组RANKLmRNA表达的总体比较具有显著性差异（F=161.360 P＜0.001），L组、M组、H组RANKL mRNA呈现低表达水平，分别是（0.89±0.05）、（0.48±0.06）、（0.23±0.03），其中M组、H组与空白对照组（1±0.09）比较，结果有显著差异（P＜0.01）。各组OPG／RANKL比例的总体比较具有显著性差异（F=26.282P＜0.001），与空白对照组比较，L组、M组、H组的OPG／RANKL比值差异均有统计学意义（P＜0.001）。（4）对p38和磷酸化p38的检测：Western-blot检测发现，各组p38总蛋白表达的比较无显著性差异（F=0.117 P＞0.05），而各组磷酸化p38蛋白表达的比较有显著性差异（F=63.715 P＜0.001），且L组、M组、H组磷酸化p38与空白组比较明显增加。2．经SB203580干预作用后OB各指标变化如下：（1）细胞增殖率：各组细胞增殖率的总体比较具有显著性差异（F=7.971P＜0.010）。SB组、SB+GLP组与空白组对照比较，增值率分别是（99.12±15.16）、（100.8±16.6）、（100±14），三者结果无显著性差异（P＞0.05）。而SB+GLP组与HD组比较，HD组细胞增殖率为（136.78±16.49），两者有显著性差异（P＜0.05）。（2）矿化结节数目：各组矿化结节数的总体比较具有显著性差异（F=79.638 P＜0.001）。SB组、SB+GLP组与空白组对照比较，矿化结节数为（70.67±6.1）、（78±14.5）、（78.33±9.5），结果无显著性差异（P＞0.05）。而SB+GLP组与HD组比较，HD组矿化结节数为（168±17.1），两者有显著性差异（P＜0.01）。（3）real time PCR测定OB的OPG mRNA表达：各组OPG mRNA的总体比较具有显著性差异（F=112.374 P＜0.001）。SB组、SB+GLP组与空白组对照比较，OPGmRNA为（0.96±0.11）、（1.07±0.08）、（1±0.11），结果无显著性差异（P＞0.05）。而SB+GLP组与HD组比较，HD组OPGmRNA为（2.93±0.42），两者有显著性差异（P＜0.01）。（4）real time PCR测定OB的RANKLmRNA表达：各组RANKL mRNA的总体比较具有显著性差异（F=38.333 P＜0.001）。SB组、SB+GLP组与空白组对照比较，RANKLmRNA为（0.93±0.11）、（1.03±0.09）、（1±0.11），结果无显著性差异（P＞0.05）。而SB+GLP组与HD组比较，HD组RANKLmRNA为（0.51±0.09），两者有显著性差异（P＜0.01）。OPG／RANKL比例各组总体比较有显著性差异（F=56.028 P＜0.001），B组、SB+GLP组与空白组RANKLmRNA对照比较，结果无显著性差异（P=0.999＞0.05、P=1.000＞0.05），而SB+GLP组与HD组比较，HD组OPG／RANKL比例较高，两组结果有显著性差异（P=0.004＜0.01）。（5）对p38和磷酸化p38的影响：各组p38总蛋白的总体比较无显著性差异（F=0.360 P＞0.050）。而各组磷酸化p38的总体比较具有显著性差异（F=2405.374 P＜0.001）。SB组、SB+GLP组磷酸化p38含量明显减少，与HD组比较两者有显著性差异（P＜0.01）。结论GLP可能通过p38MAPK信号通路，增加OB的细胞增值率和矿化结节数，促进OPG的基因表达，下调RANKL基因表达水平，提高OPG／ANKL比值，从而促进OB分化、成熟，促进骨形成功能。