论文摘要
多不饱和脂肪酸（PUFAs）为人体健康所必需，具有重要的生理功能。高山被孢霉油脂合成能力很强，可达细胞干重的50%以上。高山被孢霉不仅是花生四烯酸（AA）的工业化生产菌株，而且是合成PUFAs真菌中唯一具有正式安全性评估的菌种，可直接用于食用脂质生产，代替或补充传统脂质资源。本论文通过基因组、脂质组、转录组、蛋白质组以及生物信息学等研究手段，在分子水平上解析高山被孢霉脂质代谢流网络，揭示其脂质合成机理。这为重构高山被孢霉脂肪酸代谢通路，使之成为生产功能性脂质的细胞工厂提供了理论依据。主要研究成果如下：（1）完成了高山被孢霉基因组31.75倍覆盖率的测序分析，高山被孢霉是毛霉亚门中第二个完成全基因组信息破译的菌株。基因组大小为38.38Mb，GC含量51.72%。基因组注释结果包括12796个基因模型，平均转录长度为1.5kb。每个多外显子基因平均有3.32个内含子，26%的预测基因为单外显子转录。外显子平均大小为435bp，内含子平均大小为140bp。线粒体基因组大小为67445bp，分别编码了28个tRNA，3个非编码RNA，12个已知蛋白和13个未知蛋白。在此研究基础上从基因层面研究了产油真菌与非产油真菌的进化关系，结果显示产油真菌脂质合成相关基因主要来自于直系遗传而不是旁系遗传，最后基于基因组信息初步构建了高山被孢霉脂质合成的完整代谢网络，进而解析了脂质合成机理。（2）完成了高山被孢霉在不同温度培养条件下脂质组学研究，分析了脂肪酸、甘油脂、甘油磷脂、鞘脂以及甾醇的含量。高山被孢霉最主要的脂质产物是甘油脂（430mol/g，占89%），其次是甘油磷脂（154mol/g，占8%）和甾醇（14.5mol/g，占3%），以及少量的鞘脂（30.5nmol/g，占0.008%）。高山被孢霉在25C及12C培养时都积累了大量的脂质，达到细胞干重的45%，其中AA的含量占总脂肪酸含量的50%以上。在不同温度的培养条件下，饱和脂肪酸（SAFA）及ω-6PUFAs的含量没有变化，而在12C培养时，高山被孢霉ω-3PUFAs的含量显著增加。（3）氮源是影响微生物脂肪积累的重要因素。本论文研究了氮源消耗过程中高山被孢霉的脂肪积累及生物量变化情况。当氮源耗尽而碳源仍然存在时，高山被孢霉的生长受到限制，此时脂肪开始积累作为能量储存。选取氮源耗尽前后下列时间点的样品（A：8h，B：18h，E：19.5h，K：21h，L：32h和M：68h），利用高通量测序手段对这些样品进行了转录组测序，研究了脂质合成相关基因的转录水平变化。高山被孢霉基因组中88%的基因得以表达，其中33%基因编码的蛋白质功能未知。高山被孢霉的基因表达情况异常活跃，其表达水平从无法检测一直到73528FPKM不等。本文系统探讨了TCA循环、糖酵解途径、脂肪酸合成途径和甘油脂合成途径与脂肪积累的关系。对分别在25C及12C培养的高山被孢霉样品进行了蛋白质组学分析，共分离出555个表达差异蛋白，并对结果进行了RT-PCR验证。结果表明，磷酸戊糖途径、糖酵解途径以及TCA循环的共同调控为高山被孢霉的脂质合成提供了大量的乙酰辅酶A和NADPH。（4）对真菌中独特的代谢途径进行了分析和验证，首次在真菌中完成了对四氢生物蝶呤（BH4）代谢途径和苯丙氨酸羟化系统的分子生物学鉴定。在大肠杆菌中完成了上述代谢途径中相关基因的克隆和表达，利用His-tag标签对这些酶进行了纯化。通过HPLC及紫外分光光度计检测了重组蛋白的活性，对酶学性质进行了研究，并对这些酶基因进行了序列比对与进化分析。探讨了BH4在高山被孢霉体内的生理功能，BH4可作为苯丙氨酸羟化酶（PAH）的辅助因子，参与苯丙氨酸代谢。研究了高山被孢霉体内苯丙氨酸羟化系统与脂质合成的关系，PAH活性受抑制时，脂肪酸组分发生了明显变化，SAFA，ω-6PUFA，ω-3PUFA，和总脂肪酸含量分别下降了30%，50%，20%和30%，而单不饱和脂肪酸（MUFA）的含量增加了30%。解析了高山被孢霉在真菌中独特的苯丙氨酸降解策略，高山被孢霉通过苯丙氨酸羟化系统将苯丙氨酸转化为酪氨酸，进一步转化为尿黑酸，最终生成乙酰辅酶A。
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