小麦TaMBD2基因的全长cDNA克隆及互作蛋白的筛选

论文摘要

为了探讨甲基结合蛋白TaMBD2在小麦生长发育过程中的调控功能,通过RACE技术克隆了小麦TaMBD2基因I的cDNA全长,构建了TaMBD2的酵母表达载体,并利用酵母双杂交系统对TaMBD2互作蛋白进行了初步筛选,主要研究内容如下：1.通过RACE技术克隆到了TaMBD2的cDNA全长,序列分析显示,TaMBD2的cDNA全长为1511bp,其中5’-UTR164bp,3’-UTR405bp, ORF942bp;该基因编码的蛋白包含313个氨基酸,推测的分子量为34.65kD,等电点为5.21；氨基酸序列分析发现,TaMBD2包含典型的甲基结合蛋白保守域（143～221位氨基酸）和1个CW型的锌指结构域（80-132位氨基酸）。甲基结合蛋白保守域与玉米的MBD111（EU965071）、 MBD108（AY029560）和拟南芥的AtMBD2（NM203121）的一致性分别为96%、92%和68%；三维结构预测显示,TaMBD2的甲基结合域可形成由3个p-折叠和2个α-螺旋组成的特定夹层结构。2.成功构建了酵母诱饵农达载体PGBKT7-TaMBD2,并验证了在酵母细胞中没有毒性和自激活,Western blot检测能成功表达出日的蛋白。3.利用酵母双杂交系统筛选TaMBD2的互作蛋白,总共筛选到了91个克隆,其中37个完成了测序,blastx分析结果表明,其中有21个序列推测编码NDPK3（nucleoside diphosphate kinase,二磷酸核苷激酶）,有9个序列推测编码ENTH结构域蛋白（epsin N-terminal homology domain-containing protein）,其余的功能推测分别为SIAN蛋白（seven in absentia family protein）, Agenet结构域蛋白（agenet domain-containing protein）; C2H2型锌指蛋白（zinc finger C2H2type family protein）和假定蛋白（hypothetical protein）4.NDPK在生物体内广泛存在并且高度保守,是一类催化NTP的Y-磷酸基因转移到NDP的酶类,在维持细胞内三磷酸核苷酸的平衡中发挥着重要的功能,另外它可以通过影响细胞骨架面引起细胞运动,使G蛋白激活,从面介导细胞信号传导,最近的研究表明,NDPK蛋白可能发挥其他重要的调控功能。ENTH结构域蛋白是一类也在植物体广泛分布,参与膜运输的蛋白。其主要在招募泛素化蛋白结合在一定位点上,并且帮助包被液泡形成过程中改变膜的状态中发挥功能。在本实验中初步筛选到能与TaMBD2互作的主要蛋白为NDPK和ENTH,推测其可能与TaMBD2互作在小麦生长发育的调控方面发挥重要的功能,但具体的互作机制及生物学功能有待于进一步研究。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 1 文献综述
• 1.1 植物DNA甲基化
• 1.1.1 DNA甲基化机制
• 1.1.2 DNA甲基化调节基因表达的机制
• 1.1.3 植物DNA甲基化的生物学功能
• 1.2 植物MBD蛋白
• 1.2.1 MBD蛋白的结构特点
• 1.2.2 MBD蛋白的功能
• 1.2.3 小麦MBD蛋白
• 1.3 酵母双杂交系统介绍
• 1.3.1 酵母双杂交原理
• 1.3.2 酵母双杂交系统的特点
• 1.3.3 酵母双杂交系统的缺陷及改进
• 1.3.4 酵母双杂交系统的应用
• 1.3.5 本文选择的酵母双杂交系统
• 2 引言
• 3 材料与方法
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 菌株
• 3.1.3 质粒载体
• 3.1.4 工具酶及试剂盒
• 3.1.5 主要仪器
• 3.1.6 PCR引物
• 3.1.7 LB培养基
• 3.1.8 酵母培养基
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 总RNA提取及质量鉴定
• 3.2.2 目的基因的3’RACE克隆
• 3.2.3 目的基因的5’RACE克隆
• 3.2.4 酵母双杂诱饵载体的构建和酵母转化
• 3.2.5 酵母双杂诱饵蛋白自激活和毒性检测
• 3.2.6 Western blot检测诱饵蛋白的表达
• 3.2.7 酵母双杂交文库筛选互作蛋白
• 3.2.8 测序确认编码互作蛋白的基因
• 4 结果与分析
• 4.1 TaMBD2基因的全长 cDNA序列分析
• 4.1.1 总RNA的提取和质量检测
• 4.1.2 小麦TaMBD2全长 cDNA的克隆及序列分析
• 4.2 小麦TaMBD2编码蛋白质的结构特性分析
• 4.3 酵母双杂诱饵载体PGBKT7-TaMBD2在酵母细胞中的表达
• 4.3.1 酵母双杂诱饵载体PGBKT7-TaMBD2的构建和鉴定
• 4.3.2 Western blot检测诱饵蛋白在酵母细胞中的表达
• 4.4 诱饵蛋白的自激活检测
• 4.5 诱饵蛋白的毒性检测
• 4.6 阳性对照和阴性对照结果分析
• 4.7 TaMBD2互作蛋白筛选结果分析
• 5 结论与讨论
• 5.1 获得了小麦甲基结合蛋白基因TaMBD2的cDNA全长
• 5.2 构建了酵母诱饵表达载体PGBKT7-TaMBD2
• 5.3 利用酵母双杂交系统筛选TaMBD2互作蛋白
• 参考文献
• Abstract