拟南芥细胞中DNA错配修复机理的研究

论文摘要

不同基因型的植物物种或品种间的杂交育种是近代育种的最重要的方法之一,也是培育新品种的主要途径。杂交育种的一个主要目的是整合来自不同物种或品种的各种优良性状,而减数分裂时的DNA的同源重组对这一进程至关重要。研究表明DNA错配修复系统在DNA重组和种间杂交方面起着至关重要的作用,在很大程度上调控着有丝分裂和减数分裂过程中DNA的重组及其效率,限制异源DNA序列的重组。因此,深入地研究植物的DNA错配修复机制将为作物育种提供有效的理论依据和实际应用价值。可是,对植物细胞中DNA错配修复的研究还处于起步阶段,鲜有涉及分子、生理和生化机制方面的研究报道。迄今为止,还没有直接的实验能够证明植物细胞中是否存在DNA错配修复体系；其主要原因是缺少直接检测植物细胞中DNA错配修复的有效手段,缺乏完善的分析研究体系。本研究以此为切入点,建立了一个检测拟南芥细胞中DNA错配修复的研究体系,从体内和体外两个方面首次证明了拟南芥细胞中具有DNA错配修复活性。主要研究结果如下：1.尽管拟南芥细胞核蛋白可能具有修复错配DNA的功能,但体外反应结果表明,拟南芥核蛋白能够在底物DNA的单链缺刻（Nick）处制造双链断裂,这种双链断裂的DNA产物能够掩盖微量的修复的DNA底物,给检测被修复好的DNA底物带来了困难。因此,尝试了各种检测方法,最终建立了有效的分析方法。2.利用单链切割内切酶、通过单链置换的方式、制备了含有T-T和G-Deletion错配的LUC （Luciferase） DNA底物。将这类错配的LUC底物在原生质体内瞬时表达,然后通过检测LUC的表达水平来分析判断细胞中是否存在将错配的LUC底物成功修复的机制。实验结果显示,的确可以在转化错配底物的原生质体中检测到LUC活性,暗示拟南芥细胞可能具有DNA错配修复活性；不仅如此,进一步的实验表明这种体内DNA错配修复进程是由Nick引导的。3.从拟南芥原生质体中分离和提取细胞核蛋白,利用连接介导的DNA检测技术（LMDA）首次在体外检测到了拟南芥（野生型）核蛋白的DNA错配修复活性。对缺失突变体msh2的研究表明,msh2的核蛋白的错配修复活性大大低于野生型,说明AtMsh2可能参与了拟南芥DNA错配修复反应。进一步的体外错配修复实验表明,拟南芥的体外错配修复反应也是由Nick引导的。细胞转化技术作为一项重要的生物学研究工具,不管是对于哺乳动物研究,还是对于植物学研究都有着极大的推动作用。传统的转化技术都是将携带有目的基因片段的质粒作为载体进行转化操作的。然而,在进行拟南芥DNA错配修复的研究过程中,意外地发现PCR扩增的DNA片段（PCR-fragment）能够被转化至植物细胞中并瞬时表达。因此,一个适用于植物细胞的、转化PCR-fragment的瞬时表达体系（PCR-fragment based transient expression system, PCR-TES）建立了起来。应用该表达体系研究了拟南芥CDPK家族基因和AITR1基因在ABA信号传导中的功能。主要研究结果如下：1.利用基因枪进行瞬时表达实验表明,PCR-fragment能够被转化至植物细胞并顺利地表达。将PCR-fragment在拟南芥原生质体中进行瞬时表达的实验结果证明,这一方法的转化效率可高达70%,远远超过普通质粒在原生质体中的转化效率,而且其转化后的蛋白表达情况与质粒的相似。进一步实验结果证明PCR-fragment能够用于各种植物细胞的瞬时表达实验,并利用该研究系统（PCR-TES）成功地重构PYR1介导的ABA信号传导通路。2.系统地筛选和分析了24个拟南芥CDPK家族基因在ABA信号传导中的作用,结果显示9个CDPK成员能够显著地上调RD29B-LUC表达。进一步的研究证明CPK4能够与ABF2和ABI1相互作用,从而在拟南芥原生质体中采用PCR-TES重构了CPK4介导的ABA信号传导通路。体外实验表明,CPK4能够直接磷酸化并激活ABF2,而且CPK4的这种磷酸化调节直接依赖于ABA及其受体复合体PYR1/ABI1的调控。3.初步研究了拟南芥AITR1基因的功能。AITR1蛋白是一个具有CHC4H3类型锌指结构的转录因子。YFP-AITR1的表达显示出其在细胞核中定位；转录激活抑制实验表明AITR1可能通过C端发挥转录抑制功能;ChIP实验显示AITR1能够绑定A/T-Rich顺势作用元件。qRT-PCR和GUS染色结果显示,AITR1能够受ABA诱导表达,并在分生组织和新生器官中具有很强烈的表达模式：伴随着组织和器官的成熟AITR1表达量逐渐降低。对AITR1超表达株系的表型观察显示,其在子叶变绿过程中对ABA呈超敏感表型,暗示AITR1在ABA信号传导中可能起调节作用。此外,BiFC实验和体外Pull-down实验结果表明,AITR1能够与CPK4相互作用,推测ABA可能通过CPK4磷酸化调节AITR1的功能,从而调控植株的生长发育。

论文目录

• 论文主要创新点
• 摘要
• Abstract
• 第一部分 植物细胞中DNA错配修复机理的生物化学研究
• 1 文献综述
• 1.1 错配修复与同源重组
• 1.2 原核生物中的错配修复机制
• 1.3 真核生物中错配修复机制
• 1.4 真核生物中DNA错配修复研究体系
• 1.5 植物错配修复研究进展
• 1.6 目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 错配DNA底物
• 2.1.3 寡聚核酸序列
• 2.1.4 试剂耗材
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 质粒构建
• 2.2.2 LUC错配底物的制备
• 2.2.3 原生质体分离与转化
• 2.2.4 在原生质体中检测DNA的错配修复
• 2.2.5 XhoI-Adapter制备
• 2.2.6 连接介导的体外错配修复实验（LMDA）
• 2.2.7 拟南芥幼苗组织细胞核蛋白的提取
• 2.2.8 拟南芥原生质体核蛋白提取
• 3 实验结果与分析
• 3.1 体外检测拟南芥核蛋白对错配DNA底物的修复作用
• 3.1.1 体外DNA错配修复实验原理
• 3.1.2 拟南芥幼苗细胞核蛋白提取
• 3.1.3 体外检测拟南芥核蛋白的DNA错配修复活性
• 3.1.4 采用地高辛标记的方法检测拟南芥核蛋白的体外错配修复结果
• 3.2 在拟南芥原生质体内检测DNA错配修复的活性
• 3.2.1 制备含有错配DNA碱基的LUC底物
• 3.2.1.1 利用单链置换法制备错配底物的设计原理
• 3.2.1.2 制备和验证含有错配碱基的LUC底物
• 3.2.2 拟南芥原生质体内的DNA错配修复活性的检测
• 3.2.3 Nick对拟南芥体内错配修复的影响
• 3.3 采取LMDA研究拟南芥核蛋白的DNA错配修复活性
• 3.3.1 连接介导的DNA检测方法（LMDA）的设计与验证
• 3.3.1.1 LMDA的设计原理
• 3.3.1.2 采用LMDA检测DNA修复错配结果的可行性分析
• 3.3.2 拟南芥核蛋白DNA错配修复活性的体外检测
• 3.3.2.1 拟南芥原生质体细胞核蛋白的提取
• 3.3.2.2 拟南芥DNA错配修复活性的体外检测
• 3.3.3 msh2缺失突变体的DNA错配修复活性检测
• 3.3.4 拟南芥DNA错配修复依赖于底物上的Nick
• 4 讨论
• 4.1 植物DNA错配修复实验的难点
• 4.2 通过检测LUC的活性分析植物细胞中DNA错配修复机制的存在
• 4.3. 植物细胞核蛋白提取物具有微弱的错配修复活性
• 4.4 连接介导的DNA检测技术（LMDA）的优点
• 5 结论
• 6 参考文献
• 第二部分 PCR-TES的建立及其在研究ABA信号传导通路中的应用
• 1 文献综述
• 1.1 哺乳动物细胞瞬时转化技术
• 1.2 植物细胞瞬时转化技术
• 1.2.1 农杆菌转化法
• 1.2.2 原生质体转化法
• 1.3 PCR片段在哺乳动物细胞转化技术中的应用
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 质粒
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 试剂耗材
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 PCR-fragments的制备
• 2.2.2 植物基因组DNA和RNA提取
• 2.2.3 基因克隆与表达载体的构建
• 2.2.4 氯化铯梯度离心制备和纯化质粒
• 2.2.5 原生质体分离与转化
• 2.2.6 基因枪瞬时转化
• 2.2.7 蛋白斑点杂交
• 2.2.8 重组蛋白的原核表达与纯化
• 2.2.9 体外磷酸化检测实验
• 2.2.10 结合PCR-TES的ChIP分析
• 3 实验结果与分析
• 3.1 PCR-TES研究方法的建立和评估
• 3.1.1 PCR-fragments的制备
• 3.1.2 基因枪法瞬时转化PCR-fragments到植物细胞中
• 3.1.3 PCR-TES在植物蛋白亚细胞定位研究中的应用
• 3.1.4 PCR-fragments在原生质体中的瞬时表达分析
• 3.1.4.1 PCR-fragments转化到拟南芥原生质体中
• 3.1.4.2 PCR-fragments和质粒转化效率的比较
• 3.1.4.3 鉴定和分析PCR-TES体系的蛋白表达情况
• 3.1.4.4 评估Fusion PCR方式制备的PCR-fragments在原生质体中的表达
• 3.1.4.6 评估来源于基因组DNA的PCR-fragments在原生质体中的表达
• 3.2 PCR-TES体系的验证
• 3.2.1 在PCR-TES中检测激素相关基因的表达
• 3.2.2 重构PYR1介导的ABA信号通路
• 3.3 应用PCR-TES筛选和分析CDPK家族基因在ABA信号传导中的作用
• 3.3.1 筛选参与ABA信号传导的CDPK家族的成员
• 3.3.2 候选CDPK基因在ABA信号传导中的功能分析
• 3.3.3 重构CPK4介导的ABA信号通路
• 3.4 拟南芥转录因子AITR1的初步研究
• 3.4.1 拟南芥AITR1基因的生物信息学分析
• 3.4.2 AITR1具有转录抑制功能
• 3.4.3 AITR1可能绑定A/T-Rich顺势作用元件
• 3.4.4 ABA能够诱导拟南芥AITR1的表达
• 3.4.5 拟南芥AITR1的组织定位
• 3.4.6 AITR1超表达株系对ABA超敏感
• 3.4.7 AITR1与CPK4相互作用
• 4 讨论
• 4.1 PCR-TES适用于植物细胞瞬时表达
• 4.2 应用PCR-TES筛选和分析拟南芥CDPK家族基因的功能
• 4.3 AITR1参与拟南芥ABA的信号传导
• 5 结论
• 6 参考文献
• 附录
• 附录-Ⅰ 培养基
• 附录-Ⅱ 主要化学试剂和仪器
• 在读期间已发表和正在整理的论文
• 致谢