论文题目: 热纤维梭菌β-葡聚糖酶热稳定性机制的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 动物营养与饲料科学
作者: 李卫芬
导师: 许梓荣
关键词: 热纤维梭菌,葡聚糖酶,热稳定,芽孢杆菌,突变酶,催化结构域,末端,末端,关键氨基酸
文献来源: 浙江大学
发表年度: 2005
论文摘要: β-葡聚糖酶是重要的饲用酶制剂,它能特异性地降解β-葡聚糖中与β-1,3键相邻的β-1,4键,从而可消除由β-葡聚糖引起的抗营养作用。β-葡聚糖酶主要来源于微生物,其中热纤维梭菌β-葡聚糖酶有较高的热稳定性,耐热温度可达80℃。因此,本研究通过基因缺失、突变及构建杂合基因等方法系统地研究了热纤维梭菌β-葡聚糖酶的耐热机制,主要研究内容和结果如下: (1) 构建和表达了热纤维梭菌β-葡聚糖酶成熟肽(licMB)及其2个缺失酶(LicMB△238-305 and LicMB△217-305)。LicMB△238-305为licMB在C-末端缺失了锚定结构域(dockerin domain,68个氨基酸残基组成)的缺失酶;LicMB△217-305为同时缺失了连接子(Thr-Pro-box,21个氨基酸残基组成)和锚定结构域(dockerin domain)的缺失酶。酶特性研究表明:LicMB△238-305和LicMB△217-305的比活分别比LicMB高90.58%和36.65%;75℃处理10min,LicMB△238-305、LicMB和LicB△217-305的残余酶活力分别为100%、86.05%和79.09%,LicMB△238-305的热稳定性高于licMB和LicMB△217-305。以上结果说明热纤维梭菌β-葡聚糖酶锚定结构域的存在会降低酶活力和热稳定性,而连接子的存在会提高酶活力和热稳定性,这二个区域对酶的作用相互抵消。因此,热纤维梭菌β-葡聚糖酶成熟肽的热稳定性与其结构域相当,即热纤维梭菌β-葡聚糖酶的热稳定性与其C-末端尾巴无关,而与其催化结构域有关。 (2) 以LicMB-CD(热纤维梭菌β-葡聚糖酶催化结构域)为材料,构建和表达了7个N-末端缺失和3个C-末端缺失的LicMB-CD缺失酶。7个N-末端缺失酶定名为LicMB-CD△N3、LicMB-CD△N5、LicMB-CD△N7和LicMB-CD△N9、LicMB-CD△N11、LicMB-CD△N13和LicMB-CD△N25,分别在N-末端缺失3、5、7、9、11、13和25个氨基酸残基;3个C-末端缺失酶定名为LicMB-CD△C3、LicMB-CD△C6和LicMB-CD△C9,分别在C-末端缺失3、6和9个氨基酸残基。研究结果发现:与亲本酶(LicMB-CD)相比,LicMB-CD△N3、LicMB-CD△N5、LicMB-CD△N7和LicMB-CD△N9热稳定性都有不同程度的下降,70℃处理10min,残余酶活力均在70%以上;75℃处理10min,LicMB-CD(亲本酶)、LicMB-CD△N3、
论文目录:
主要英文缩写词
中文摘要
英文摘要
第一章 文献综述
第一节 嗜热酶热稳定性机制研究进展
1 嗜热酶的定义
2 嗜热酶的热稳定性
3 影响酶热稳定性的因素
3.1 蛋白质分子内有更多的作用力
3.2 更好的蛋白质构型
3.3 优化氨基酸组成
第二节 β-葡聚糖酶的研究进展
1 前言
2 β-葡聚糖酶的分子生物学研究
2.1 β-葡聚糖酶基因克隆
2.2 β-葡聚糖酶基因表达
3 β-葡聚糖酶的生化特性
4 结构与功能
4.1 酶的作用机理
4.2 催化氨基酸残基
4.3 三级结构和折叠
5 突变研究和蛋白质工程
5.1 蛋白质和碳水化合物的相互作用：底物特异性
5.2 杂合酶与热稳定性
5.3 循环重排
第三节 本研究目的和意义
第二章 热纤维梭菌β-葡聚糖酶C-末端结构域对其热稳定性的影响
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 培养基及主要化学试剂的配制
1.3 方法
1.3.1 热纤维梭菌β-葡聚糖酶成熟肽基因的表达
1.3.2 热纤维梭菌β-葡聚糖酶成熟肽缺失基因的表达
1.3.3 SDS-PAGE
1.3.4 β-葡聚糖酶活力测定
1.3.5 β-葡聚糖酶特性的分析
2 结果
2.1 β-葡聚糖酶成熟肽(LicMB)及其二个缺失酶基因的克隆
2.2 LicMB及其二个缺失酶基因的表达
2.3 LicMB及其二个缺失酶的活力
2.4 LicMB及其二个缺失酶的最适作用温度
2.5 LicMB及其二个缺失酶的热稳定性
3 讨论
3.1 酶的表达
3.2 LicMB及其二个缺失酶的活力
3.3 LicMB及其二个缺失酶的最适温度
3.4 LicMB及其二个缺失酶的热稳定性
4 小结
第三章 LieMB-CD N-和C-末端缺失对其热稳定性的影响
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 LicMB-CD N-或C-末端缺失基因的克隆
2.2 LicMB-CD N-和C-末端缺失基因的表达
2.3 LicMB-CD N-和C-末端缺失酶的活力
2.4 LicMB-CD N-和C-末端缺失酶的最适作用温度
2.5 LicMB-CD N-和C-末端缺失酶的热稳定性
3 讨论
3.1 LicMB-CD N-末端氨基酸缺失对酶特性的影响
3.2 LicMB-CD C-末端氨基酸残基缺失对酶特性的影响
3.3 酶的亲热性和耐热性
4 小结
第四章 LicMB-CD N末端氨基酸突变对其热稳定性的影响
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 LicMB-CD N末端突变基因的克隆
2.2 LicMB-CD N末端突变基因的表达
2.3 LicMB-CD N末端突变酶的活力
2.4 LicMB-CD N末端突变酶的热稳定性
3 讨论
4 小结
第五章 LicMB-CD末端序列对芽孢杆菌β-葡聚糖酶热稳定性的影响
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 杂合β-葡聚糖酶基因的克隆
2.2 杂合β-葡聚糖酶基因的表达
2.3 杂合β-葡聚糖酶的活力
2.4 杂合β-葡聚糖酶的最适作用温度
2.5 杂合β-葡聚糖酶的热稳定性
3 讨论
3.1 LicMB-CD N7C3对β-葡聚糖酶特性的影响
3.2 LicMB-CDN端氨基酸残基对β-葡聚糖酶特性的影响
3.3 LicMB-CD C-末端氨基酸残基对β-葡聚糖酶特性的影响
4 小结
第六章 H-N104C8-B氨基酸突变对其热稳定性的影响
1 材料和方法
1.1 材料
1.2 方法
2 结果
2.1 HN104C8突变基因的克隆
2.2 HN104C8突变基因的表达
2.3 HN104C8突变酶的活力
2.4 HN104C8突变酶的最适温度
2.5 HN104C8突变酶的热稳定性
3 讨论
3.1 HN104C8第197-202位突变对β-葡聚糖酶特性的影响
3.2 H-N104C8第189-193位氨基酸突变对β-葡聚糖酶特性的影响
3.3 H-N104C8第165-172位氨基酸突变对β-葡聚糖酶特性的影响
3.4 T144E和Y124WGl28E突变对β-葡聚糖酶特性的影响
4 小结
论文小结
创新点
参考文献
附：发表论文
致谢
发布时间: 2005-07-27
参考文献
- [1].组织特异性表达1，3-1，4-β-葡聚糖酶转基因鼠及猪的制备[D]. 关立增.吉林大学2013
- [2].重组里氏木霉产高活力内切-β-葡聚糖酶的研究[D]. 顾斌涛.浙江大学2013
- [3].热稳定性β-葡聚糖酶的克隆、表达及定向进化研究[D]. 毛淑蕊.南京农业大学2013
- [4].内切型-β-葡聚糖酶基因的克隆与表达[D]. 金欣.浙江大学2011
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