论文摘要
目的:应用酵母双杂交系统和免疫荧光技术研究野生型和变异型LRR（Il122V）主域在体外与parkin分子之间是否存在相互作用,为逐个解析LRRK2蛋白其他主域的功能,全面探讨LRRK2蛋白在帕金森病发病机制中作用的后续研究奠定基础。方法:通过分子克隆技术构建诱饵pGBDU-LRR质粒,转染进入酵母菌成为PJ69-4α/pGBDU-LRR菌株,应用酵母双杂交系统在猎物书架（prey of bookshelf）中筛选出可能与野生型LRRK2蛋白的LRR主域存在相互作用的蛋白。随后分别转染含FLAG标记的PRK5-parkin质粒（对照组）,HA标记的野生型pCMV-LRR质粒+PRK5-parkin质粒（实验组1,parkin+LRR（W））,HA标记的变异型pCMV-LRR质粒+PRK5-parkin质粒（实验组2,parkin+LRR（M））,采用Hoechst染色试剂盒检测细胞凋亡,western blot检测parkin蛋白和野生型/变异型LRR主域的表达,免疫荧光技术进一步观察野生型/变异型LRR主域在细胞内是否共定位,免疫沉淀技术证实LRR主域在体外与parkin分子之间是否存在相互作用。结果:我们通过酵母双杂交系统从猎物书架中筛选出parkin分子可能与野生型LRR主域之间存在相互作用,通过共同转染野生型/变异型pCMV-HA-LRR质粒和PRK5-FLAG-parkin质粒进入HEK293细胞,western blot检测到parkin蛋白和野生型/变异型LRR主域在HEK293细胞成功表达,免疫荧光技术观察到parkin在细胞胞浆中表达（绿色荧光）,野生型LRR亦在细胞胞浆中表达（红色荧光）,融合后,可见parkin与野生型LRR共同转染的HEK293细胞胞浆呈橙色,说明两者之间在细胞内共定位,可能存在相互作用;然而变异型LRR在HEK293细胞的胞核中形成包涵体,融合后核内的包涵体仍然为红色,说明parkin与变异型LRR在体外表达时细胞内定位不同,两者之间没有相互作用。免疫沉淀实验进一步证实parkin分子与野生型LRR主域之间存在相互作用。Hoechst染色发现细胞凋亡比率较对照组、实验组1明显升高,免疫荧光也表明实验组2的细胞核内有类似于路易体的包涵体形成,所以我们建立了帕金森病的细胞模型。结论:野生型LRRK2蛋白的LRR主域在体外表达时与parkin位于细胞内同一亚结构,两者之间存在相互作用。突变的LRR主域（Il122V）与parkin之间的相互作用缺失。变异型LRRK2蛋白之LRR主域与parkin在体外共同表达时可以形成类似路易体样的细胞核内包涵体。
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标签：帕金森病论文; 主域论文; 蛋白间的相互作用论文;