重组人Jagged1蛋白的表达及其对HL60细胞作用的实验研究

论文摘要

从果蝇到人类,Notch途径的遗传特征高度保守;而在哺乳动物中,其构成更为复杂。相邻细胞表面的配体与受体相互作用导致Notch蛋白连续裂解,释放出受体的胞内段（NICD）。NICD转入细胞核内,使得CBF1/Su（H）/LAG1（CSL）转录因子从一个抑制物转变为转录激活物。Notch信号途径与细胞的分化、增殖和凋亡密切相关,并影响多种器官的发育和功能。另外,Notch信号的异常还与肿瘤的发生密切相关。Notch信号与肿瘤的关系首先在急性T淋巴细胞白血病（T-ALL）中得以证实,染色体t （7;9） （q34;q34.3）易位,最终导致T淋巴细胞白血病的发生。与T-ALL相比,Notch信号在急性髓系白血病（AML）中的作用尚不明确。Notch信号的激活依赖于受体与配体的结合,我们通过酵母和原核表达获得了Notch配体蛋白。原核表达系统由于没有翻译后加工修饰系统,表达的真核细胞蛋白质多以包涵体形式表达,复性纯化方法复杂。作为真核生物,毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点:如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此,操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价,且表达水平更高。因此在Notch配体的表达中我们首先选择了毕赤酵母。我们主要进行了如下几方面的研究:1、毕赤酵母表达重组人hJagged1蛋白。用RT-PCR从人骨髓细胞中扩增hJagged1基因的胞外段。测序正确后,将hJagged1基因的胞外段插入构建好的PIC-Fc载体,得到PIC-hJagged1ext-Fc。用MD平板筛选重组子, G418筛选高拷贝转化子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE分析表达蛋白。2、重组hJagged1的原核表达。构建原核表达载体pGEX-hJagged1,将构建重组原核表达载体pGEX-hJagged1转化大肠杆菌BL21后,予以IPTG诱导,优化诱导条件,使目的蛋白hJagged1在上清中有较大量表达。大量诱导细菌,用Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱对可溶性的目的蛋白进行纯化。3、重组hJagged1蛋白生物学功能的检测。通过报告基因实验检测重组hJagged1的生物学活性,并通过Notch下游分子Hes1、Hes5的表达检测其对Notch信号的激活作用。4、Notch信号对HL60细胞的作用。为了进一步研究Notch信号与AML发病的关系,我们观察了Notch信号对急性髓细胞白血病细胞系HL60的作用。我们给予外源性配体hJagged1激活Notch信号,γ分泌酶抑制剂GSI阻断Notch信号。我们通过台盼蓝染色排除死细胞后进行细胞计数,并且用瑞氏-吉姆萨染色,在光学显微镜下观察细胞的形态。细胞周期、凋亡及髓系分化的测定采用流式细胞仪。为了阐明分子机制,我们通过RT-PCR及Western blot方法检测了P21,P27,c-myc的表达及RB磷酸化的改变。结论:1、实现了hJagged1-Fc和人IgG1 Fc片段的在毕赤酵母中的表达;2、在原核表达系统实现重组GST-hJagged1的可溶性表达;3、通过报告基因实验、RT-PCR及Western blot证实重组蛋白GST-hJagged1具有生物学活性,可以激活HL60细胞中Notch信号;4、给予外源性配体刺激及γ分泌酶抑制剂阻断Notch信号对细胞分化都无影响,但GSI对HL60有明显的生长抑制作用,进一步研究发现,GSI可以诱导HL60细胞凋亡,并使细胞周期阻滞,这可能与P21,P27,c-myc表达改变及RB磷酸化有关。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 实验研究部分
• ext-Fc 毕赤酵母表达载体的构建及表达'>第一部分 融合蛋白hJagged1^ext-Fc 毕赤酵母表达载体的构建及表达
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第二部分 融合蛋白GST-hJagged1 原核表达载体的构建及表达
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 第三部分 阻断Notch 信号促进HL60 细胞凋亡
• 1 实验材料
• 2 实验方法
• 3 实验结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历
• 致谢