革兰氏阳性中度嗜盐菌响应渗透胁迫的差异蛋白质组学研究

论文题目: 革兰氏阳性中度嗜盐菌响应渗透胁迫的差异蛋白质组学研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 微生物学

作者: 冯德芹

导师: 杨苏声

关键词: 达坂喜盐芽孢杆菌,双向电泳,质谱,鉴定,差异显示蛋白质组学,高盐冲击,低渗冲击,长期高盐胁迫

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 达坂喜盐芽孢杆菌(Halobacillus dabanensis)D-8~T是一株分离自新疆达坂湖的革兰氏阳性中度嗜盐菌,能在0.5%～23%盐浓度的SW培养基上生长,最适生长盐浓度是3%～15%。为揭示革兰氏阳性中度嗜盐菌的耐盐机制,利用差异蛋白质组学研究技术,得到了高分辨率的双向电泳图谱。在电泳胶上清晰地分离出大约700个蛋白点,分子量为17.5～66kDa,等电点范围为3.5～5.9,表明D-8~T菌株中的蛋白质大多数属于酸性蛋白质。此外,大量的高丰度蛋白质集中在4.5～5.0的极窄范围的等电点区域,大多数的低丰度蛋白质分布在图谱的其他部分。 利用蛋白质组学技术研究了D-8~T菌株受到剧烈的高盐冲击时的差异表达蛋白谱,鉴定了一些与高盐冲击相关的蛋白质。采用双向电泳分离技术和ImageMasterTM 2D Platinum图像软件分析方法,对在1%盐浓度下生长的D-8~T菌株(培养18h)和受到25%盐浓度的瞬间冲击5min和50min后的蛋白质表达谱进行比较研究的结果表明,高盐冲击后总计有74个蛋白点表达量显著改变,其中24个蛋白点在高盐下表达量明显增加,8个高盐诱导的新蛋白点,以及42个表达量显著下降的蛋白点.利用MALDI-TOF/MS检测肽质指纹谱和MASCOT检索蛋白质数据库,初步鉴定了7个高盐冲击后表达量增加的蛋白质,它们涉及信号传导途径(类CheY接受器)、能量代谢途径(草酰乙酸脱羧酶、烯醇酶)、热激蛋白和分子伴侣(Ⅰ类热激蛋白,有伴侣活性的ATP酶以及ClpC ATP酶)和抗逆蛋白(烯醇酶)等。此外,ClpC ATP酶是首次鉴定存在于革兰氏阳性中度嗜盐菌中。 为了探讨D-8~T菌株受到低渗冲击时的差异表达蛋白,对生长在20%盐度下的D-8~T曲株(培养18h)受到剧烈的低渗冲击(0%盐度)5min和50min后的蛋白质表达谱进行了比较分析。结果显示,总计有39个蛋白点的表达量发生了明显改变,其中21个蛋白点的表达量明显增加(包括低渗冲击诱导出现的6个新蛋白点),18个蛋白点表达量受到抑制。经过质谱分析和数据库搜索,初步鉴定了5个低渗冲击后表达量增加的蛋白质,分别为形态检测蛋白、青霉素结合蛋白、DnaK、ClpC ATP酶和EPSPS等。此外,热激蛋白是首次鉴定在细菌受到低渗冲击时表达量增加的蛋白质。 研究了D-8~T菌株在不同盐浓度下的蛋白质表达谱,发现133个蛋白点的表达量发生了明显改变。88个蛋白点在10%和20%的高盐度下表达量显著增加,包括26个高盐诱导出现的新蛋白点;45个蛋白点在高盐度下的表达量明显下降,其中包括20个表达消失的蛋白点(有16个蛋白点只是在1%盐度中生长的细胞中才表达)。从质谱分析和蛋白质数据库匹配结果来看,D-8~T菌株在高盐浓度下生长时,表达量明显增加的蛋白质主要有以下几类:与能量代谢相关的蛋白质、参与细胞生存和增殖的蛋白质、作为全局胁迫调节子适应多种胁迫条件的蛋白质、与亲和性溶质如海藻糖和甜菜碱可能相关的蛋白质等。

论文目录:

摘要

ABSTRACT

第一章 绪论

1.1 本论文研究的理论意义和应用价值

1.2 细菌的渗透感应和渗透调节

1.2.1 细菌感应胁迫的多种途径

1.2.2 渗透感应的分子基础

1.2.3 革兰氏阳性细菌适应高渗胁迫的策略

1.2.4 革兰氏阳性细菌适应低渗胁迫的策略

1.3 蛋白质组学主要研究技术

1.3.1 蛋白质组学简介

1.3.2 蛋白质组研究的主要技术

1.3.3 蛋白质组学中的生物信息学

1.3.4 蛋白质组学研究的应用

1.4 微生物蛋白质组学研究现状

1.4.1 微生物胁迫蛋白质组学

1.4.2 病原微生物蛋白质组学

1.4.3 微生物定量蛋白质组学

1.4.4 亚细胞蛋白质组学

第二章 材料和方法

2.1 菌株与培养基

2.2 D-8~T菌株的培养和渗透胁迫处理

2.2.1 D-8~T菌株的高盐冲击

2.2.2 D-8~T菌株的低渗冲击

2.2.3 D-8~T菌株的长期盐胁迫

2.3 生长曲线的测定

2.4 蛋白质样品的制备

2.5 蛋白质样品的定量

2.5.1 粗法定量

2.5.2 Bradford法

2.6 双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)

2.6.1 试剂

2.6.2 凝胶电泳流程

2.7 图像采集和分析

2.8 蛋白点的切取和胶内酶解

2.8.1 蛋白点的切取

2.8.2 配制胶内酶解工作液

2.8.3 胶内酶解工作流程

2.8.4 肽段提取步骤

2.9 MALDI-TOF/MS分析和数据库查询

2.9.1 MALDI-TOF/MS分析

2.9.2 数据库查询

第三章 D-8~T菌株在高盐冲击下的差异蛋白质组学分析

3.1 引言

3.2 结果

3.2.1 D-8~T菌株的生长曲线

3.2.2 D-8~T菌株高盐冲击蛋白质表达谱差异显示分析

3.2.3 对高盐冲击条件下表达量显著上调的部分蛋白点的质谱鉴定和分析

3.3 讨论

3.3.1 D-8~T菌株蛋白质表达谱经图像软件分析后的结果讨论

3.3.2 D-8~T菌株部分高盐冲击后表达上调的蛋白质功能分析

3.3.3 有关蛋白质组学技术方面的讨论

3.4 本章小结

第四章 D-8~T菌株在低渗冲击下的差异蛋白质组学分析

4.1 引言

4.2 结果与讨论

4.2.1 D-8~T菌株在低渗冲击下的蛋白质差异表达谱分析

4.3 讨论

4.3.1 差异蛋白质表达谱结果讨论

4.3.2 低渗冲击后上调蛋白质鉴定结果讨论

4.3 本章小结

第五章 D-8~T菌株在长期盐胁迫下的差异蛋白质组学分析

5.1 引言

5.2 结果

5.2.1 D-8~T菌株在不同盐浓度下的蛋白质表达谱差异分析

5.2.2 对D-8~T菌株在高盐浓度下表达明显上调的部分蛋白点鉴定

5.3 讨论

5.3.1 软件分析讨论

5.3.2 蛋白质鉴定讨论

5.3.3 适应长期高盐胁迫和高盐冲击的4条共同途径

5.3.4 适应缺盐的胁迫环境

5.3.5 在不同胁迫条件下表达明显上调的蛋白质的比较分析

5.3.6 中度嗜盐菌可能的耐盐机制

5.4 本章小结

结论

参考文献

致谢

发布时间: 2005-07-18

参考文献

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• [4].极端嗜盐古菌嗜盐菌素C8的分离纯化和基因克隆[D]. 厉云.中国海洋大学2003
• [5].青海湖嗜盐菌多样性与四氢嘧啶的生物合成机制研究[D]. 朱德锐.华中师范大学2014
• [6].芳香烃类化合物降解嗜盐菌的筛选及其降解特性研究[D]. 厉阗.西南大学2012
• [7].高盐环境微生物的分离、鉴定及其在含盐废水处理中的应用研究[D]. 孟凡旭.浙江大学2009
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