论文摘要
研究背景:胰腺癌是一种起病隐匿、进展迅速、预后极差的消化道高度恶性肿瘤。早期诊断是胰腺癌以手术为主、联合运用多种方法的综合治疗体系的关键所在,血清肿瘤标记物的筛查是胰腺癌早期诊断研究的重要内容之一。本课题组提出了以肿瘤免疫理论为基础采用胰腺癌相关免疫原性膜抗原抗体作为胰腺癌诊断标记物的新构想,并设计出了胰腺癌相关免疫原性膜抗原的筛查策略。为了筛查胰腺癌相关免疫原性膜抗原进而确定胰腺癌血清抗体作为肿瘤标记物,前期实验通过运用“胰腺癌细胞株膜蛋白-免疫印记杂交-蛋白质组学”筛查方式发现,相比于正常人和慢性胰腺炎病人,胰腺癌病人体内特异性存在SLP-2和TOM40蛋白的血清抗体,从而提出SLP-2和TOM40可能为人胰腺癌相关免疫原性膜抗原,其血清抗体有可能被用作胰腺癌的肿瘤标记物,因此有必要在人胰腺癌组织中对SLP-2和TOM40的表达进行研究。研究目的:对人胰腺癌组织中SLP-2和TOM40的表达进行研究,从基因（转录）和蛋白（翻译）两个水平、细胞和组织两层面获取SLP-2和TOM40作为胰腺癌相关免疫原性膜抗原存在的客观证据;对SLP-2和TOM40进行生物信息学分析,在三株常用胰腺癌细胞系中对SLP-2和TOM40进行定位和相对表达强度研究,构建SLP-2基因RNA干扰的表达载体pGPU6/GFP/Neo-SLP-2-shRNA,为在胰腺癌中进一步开展SLP-2的研究打下一定基础。研究方法:采用Real time PCR和Western blot研究SLP-2和TOM40在胰腺癌中的表达情况,同时采用人胰腺癌组织芯片（TMA）进行SLP-2和TOM40的免疫组化染色,从组织水平获取SLP-2和TOM40作为人胰腺癌免疫原性膜抗原存在的客观证据;运用生物信息学网络平台NCBI、ASTD、Oncomine Research Platform、Gene Ontology、UCSCGenome Browser以及本地生物信息学分析软件ESvPred3D、ClustalX、TreeView对SLP-2和TOM40进行蛋白进化分析、基因可变剪接分析、电子表达谱分析、转录调控分析,同时进行三维结构预测和miRNA作用位点预测并分析SLP-2和TOM40可能的B细胞表位和CTL表位;对胰腺癌细胞株AsPC-1、BxPC-3、PANC-1进行SLP-2和TOM40的细胞免疫荧光染色,利用激光共聚焦显微镜研究其在胰腺癌细胞株中的相对表达强度和细胞定位;采用pGPU6/GFP/Neo构建用于SLP-2 RNA干扰研究的表达载体pGPU6/GFP/Neo-SLP-2-shRNA。实验结果:1.Real time PCR检测显示SLP-2和TOM40基因在10例正常胰腺组织和10例胰腺癌组织均存在表达,相对于正常胰腺组织,TOM40有高表达趋势。2.Western blot检测显示SLP-2和TOM40蛋白在10例正常胰腺组织和10例胰腺癌组织均存在表达;含75例胰腺导管腺癌的组织芯片免疫组化检测显示SLP-2和TOM40在胰腺癌细胞中存在表达,并且相对于正常胰腺组织,SLP-2和TOM40有高表达趋势。3.蛋白进化分析构建了SLP-2和TOM40系统进化树;基因调控分析提示SLP-2可能受到CEBP、ELK1等转录因子的调控,TOM40可能受到CDPCR3、PAX5等转录因子的调控;miRNA预测分析了可能调控SLP-2和TOM40的miRNA;三级结构预测获得了SLP-2可能的三级结构;抗原表位预测分析提示氨基酸序列“SSGSSRD”和“TSTSRSS”可能为SLP-2和TOM40较合理的B细胞表位,而氨基酸序列“ILEPGLNIL”和“TLNNWLATV”等可能为SLP-2和TOM40的CTL细胞表位。4.胰腺癌细胞株免疫荧光染色激光共聚焦显微镜观察显示,SLP-2主要位于胰腺癌细胞株AsPC-1、BxPC-3、PANC-1的细胞质,三株胰腺癌细胞株SLP-2的相对表达水平存在显著差异,其中PANC-1表达最高,而AsPC-1表达最低;TOM40主要位于胰腺癌细胞株AsPC-1、BxPC-3、PANC-1的细胞质,三株胰腺癌细胞株TOM40的相对表达水平存在显著差异,以PANC-1表达最高,而AsPC-1表达最低。5.预测了SLP-2 RNA干扰靶位点,挑选设计出了4个可能的干扰序列,利用其完成SLP-2RNA干扰载体pGPU6-GFP-Neo-SLP-2-shRNA的构建并成功转染胰腺癌细胞株SW1990。结论:SLP-2和TOM40在人胰腺癌组织中呈广泛性表达趋势,而病人血清内特异性存在其抗体,提示SLP-2和TOM40为人胰腺癌相关免疫原性膜抗原并在人胰腺癌中可能具有一定的代表性,为以SLP-2和TOM40血清抗体作为胰腺癌肿瘤标记物的新策略提供了一定的实验证据支持。
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