阔叶猕猴桃GalDH基因植物表达载体的构建及转化番茄的研究

论文摘要

抗坏血酸（ascorbic acid, AsA）在生物体中具有重要的代谢功能和抗氧化作用。研究表明AsA不仅是保证人类健康所必需的营养物质之一,而且对于植物自身的抗氧化、光合保护以及调节生长发育等都具有非常重要的作用。L-半乳糖脱氢酶（L-galactose dehydrogenase,GalDH）是植物抗坏血酸L-半乳糖合成途径中关键酶之一,它可能是L-半乳糖合成途径中的调控位点。本试验在获得阔叶猕猴桃（Actinidia latifolia Merr.）GalDH基因全长cDNA的基础上,构建GalDH的过量植物表达载pCSB/GalDH和RNA表达载体pHGRV/GalDH,并将过量表达载体pCSB/GalDH转入根癌农杆菌EHA105中,然后通过农杆菌介导法将pCSB/GalDH基因导入番茄（Solanum lycopersicum L）Micro-Tom,筛选获得抗性植株,对GalDH基因功能进行验证,并为高等植物抗坏血酸合成奠定材料基础。获得的主要结论如下:1.建立了Micro-Tom番茄高频再生体系试验探讨了不同激素浓度配比、暗培养时间、头孢霉素浓度等条件对再生影响,探讨了IAA对生根的影响,结果表明不定芽再生最佳的培养基配方为:MS+ZT 2.0mg/L+IAA 0.2mg/L;在MS+0.3mg/LIAA的培养基上可以再生出高质量的根,移栽成活率在80%。预培养2d,头孢霉素200mg/L可以再生出高频率的愈伤组织和不定芽。2.构建了GalDH基因过量植物表达载体pCSB/GalDH和RNAi表达载体pHGRV/GalDH用限制性内切酶BamHI和KpnI将已克隆的阔叶猕猴桃GalDH基因从克隆载体pMD-19T上切下,定向插入到植物表达载体pCSB,成功构建了阔叶猕猴桃GalDH基因植物过量表达载体pCSB/GalDH。目的基因GalDH全长经过两轮PCR反应获得带有attB位点的目的基因片段,在BP Clonase作用下,与载体pHGRV上的attP位点发生同源重组,目的基因片段整合到载体pHGRV上,最终形成携带有反向重复目的基因片段的植物表达载体,命名为pHGRV/GalDH。3.得到了Micro-Tom番茄转基因植株在建立Micro-Tom番茄子叶高频再生体系和GalDH基因植物过量表达载体pCSB/GalDH基础上,Micro-Tom番茄子叶作为外植体,利用根癌农杆菌介导法将GalDH基因转入Micro-Tom番茄。探讨了潮霉素作为抗性筛选的最佳体系。结果表明子叶经2d预培养,于OD600值为0.3～0.4的菌液中侵染10min,3d的共培养,潮霉素压力为2.5mg/L,抑菌素头孢霉素浓度为200mg/L的条件下,转化率最高,经过PCR检测GUS检测后初步确定3株抗性植株。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物AsA 的生理功能
• 1.1.1 AsA 在植物体的抗氧化系统中起着重要的作用
• 1.1.2 AsA 对植物光合作用的光抑制的重要影响
• 1.1.3 AsA 参与细胞分裂
• 1.1.4 AsA 参与细胞膨大和细胞壁软化
• 1.2 AsA 合成的合成途径
• 1.2.1 L-半乳糖途径
• 1.2.2 D-半乳糖醛酸途径
• 1.2.3 古洛糖途径
• 1.2.4 肌醇途径
• 1.3 L-半乳糖脱氢酶的研究
• 1.4 植物遗传转化
• 1.4.1 农杆菌介导的遗传转化研究进展
• 1.4.2 农杆菌介导的遗传转化机理
• 1.4.3 影响农杆菌介导法转化效率的因素
• 1.5 RNAi 技术研究
• 1.5.1 RNAi 技术的机理
• 1.5.2 RNAi 在植物基因功能的研究
• 1.6 本研究的目的意义
• 第二章 Micro-Tom 番茄高频再生体系的建立
• 2.1 材料方法
• 2.1.1 材料与试剂
• 2.1.2 无菌外植体的获得
• 2.1.3 激素浓度配比对Micro-Tom 番茄子叶再生能力影响
• 2.1.4 暗培养时间对Micro-Tom 番茄子叶再生能力影响
• 2.1.5 头孢霉素对对番茄子叶再生能力影响
• 2.1.6 IAA 浓度对Micro-Tom 番茄生根的影响
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 不同浓度组合的ZT 和IAA 对Micro-Tom 番茄子叶再生的影响
• 2.2.2 暗培养时间对Micro-Tom 番茄子叶再生的影响
• 2.2.3 头孢霉素对Micro-Tom 番茄子叶再生的影响
• 2.2.4 不同浓度IAA 对Micro-Tom 番茄生根的影响
• 第三章 GalDH 基因过量和RNAi 植物表达载体构建
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 试验材料、菌株、质粒基因序列
• 3.1.2 PCR 引物
• 3.1.3 酶及生化试剂
• 3.1.4 GalDH 过量植物表达载体的构建
• 3.1.5 RNAi 植物表达载体的构建
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 GalDH 过量植物表达载体的构建与检测
• 3.2.2 GalDH RNAi 表达载体的构建
• 第四章 GalDH 基因转化Micro-Tom 番茄植株的获得
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料与试剂
• 4.1.2 培养基配方
• 4.1.3 最佳潮霉素（Hyg）浓度筛选
• 4.1.4 转基因植株获得
• 4.1.5 转基因植株的PCR 检测
• 4.1.6 转基因植株GUS 基因检测
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 Micro-Tom 番茄子叶潮霉素抗性筛选
• 4.2.2 转基因植株的获得
• 4.2.3 转基因植株的PCR 检测
• 4.2.4 转基因植株的GUS 检测
• 第五章 讨论
• 5.1 Micro-Tom 番茄子叶再生体系的建立
• 5.2 组培苗玻璃化现象的探讨
• 5.3 头孢霉素对组培苗的影响
• 5.4 潮霉素选择压的探讨
• 5.5 GUS 检测的讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介