论文摘要
瑞氏木霉是广泛存在于自然界巾的一种腐生性丝状真菌,它能够有效地降解木质纤维素材料并以此为生。其对木质纤维素材料的降解在地球碳源循环过程巾起到了重要作用。由于具有强大的纤维素分解能力和快速生长的特点,瑞氏木霉长期以来被作为研究纤维素降解的模式菌株。瑞氏木霉对木质纤维素的降解主要依靠其强大的纤维素酶和半纤维素酶分泌能力以及有效利用底物快速生长的能力。虽然瑞氏木霉基因组编码了相对少量的纤维素酶、半纤维素酶和几丁质酶基因,但是它却能有效地感应环境中的底物（如纤维素）信号及其他环境信号并作出快速的响应以使其能适应多变的环境并繁盛整个种群,而这很大程度上是通过高效的信号转导机制实现的。尽管近几十年对瑞氏木霉纤维素酶表达调控机制的研究,使我们积累了大量关于纤维素酶及其表达调控特征的信息,然而对于瑞氏木霉是如何感受环境信号调控其牛长发育和纤维素酶合成的过程并不十分清楚。Ras小GTPase蛋白所介导的信号途径是丝状真菌感受环境信号调控发育及基因表达的重要信号转导机制,然而目前对于Ras小GTPase在瑞氏木霉中的功能并不了解。本论文主要研究了Ras小GTPase在瑞氏木霉生长发育及纤维素酶表达合成过程中的调控作用,并对其作用机制进行了初步分析。另外,由于瑞氏木霉具有强大的纤维素酶分泌能力,它被广泛地应用于纤维素酶的生产及纤维素底物的糖化发酵。然而,瑞氏木霉纤维素酶系存在缺少木质素降解酶和β-葡萄糖苷酶含量较低的缺点,这在一定程度上制约了其工业应用。为了进一步降低瑞氏木霉纤维素酶的用酶成本,我们通过基因工程的方法在瑞氏木霉中分别表达了外源性的木质素降解相关酶漆酶和过表达了其自身的p-葡萄糖苷酶,以期为酶系改良提供一种有效的策略。1.Ras小GTPase信号途径调控瑞氏木霉生长发育在瑞氏木霉基因组中,利用BLASTP程序搜索到与酿酒酵母Ras1同源性较高的5个Ras小GTPase蛋白TrRas1、TrRas2、TrRsr1、Tr107035和Tr66480。同源比对分析发现这5个蛋白均含有Ras小GTPase家族的功能相关保守结构域,并且均能在瑞氏木霉中正常表达。其中,TrRas1、TrRas2和TrRsr1在瑞氏木霉的生长发育和碳源利用过程中发挥了重要作用。具体地,敲除TrRas1导致瑞氏木霉顶端生长变慢,菌丝变得短小粗壮,菌落变小呈酵母状且不能正常延伸。相似地,TrRas2也参与调控了菌丝的顶端发育和分支形成。敲除TrRas2导致菌丝顶端生长变慢,分支增多,菌落边缘不规则,气牛菌丝变少,生孢延迟。而持续性激活TrRas2导致菌丝分支变少且倾向于顶端生长,但是仍会导致顶端延伸变慢。同时TrRas2的持续性激活也造成瑞氏木霉菌落缺少气生菌丝,不能正常牛孢。从总体上看,TrRas2在调控菌丝顶端发育及菌落形成过程中的作用没有TrRas1明显。虽然敲除TrRsr1导致瑞氏木霉顶端生长变慢,但是并不影响瑞氏术霉正常的菌丝和菌落形成及无性生殖过程。另外,TrRas2和TrRsr1的缺失会导致瑞氏木毒对羧甲基纤维素和乳糖两种碳源的利用能力降低。特别是TrRas2的缺失将导致瑞氏木霉不能降解纤维素产生水解圈,表明TrRas2可能参与了瑞氏木霉纤维素酶的表达调控。通过对TrRas1和TrRas2作用机制的探索性研究,我们发现TrRas1和TrRas2可能是通过cAMP信号途径调控了菌丝的顶端发育。首先,TrRas1和TrRas2均有升高胞内cAMP含量的作用,而TrRasl的作用更为明显。敲除TrRas1导致cAMP含量相对野牛型降低414%；持续性激活TrRas2导致cAMP水平在葡萄糖和纤维素培养基上分别升高34.5%和51.2%,但是TrRas2缺失却并未对cAMP含量造成明显影响。其次,外源添加cAMP能够部分回复TrRas1缺失造成的菌丝顶端生长缺陷。最后,我们发现TrRas1和TrRas2能够与产生cAMP的腺苷酸环化酶发生相互作用,这进一步的说明TrRas1和TrRas2可能通过调控腺苷酸环化酶的活性调节胞内cAMP从而调控了瑞氏木霉菌丝的顶端发育。同时,表达谱测序分析表明TrRas1和TrRas2调控了瑞氏木霉能量代谢和氨基酸、磷脂合成相关基因的表达,从而影响了瑞氏木霉的生长和细胞膜形成等过程,进而调控了瑞氏木霉菌丝的发育。2. TrRas2介导的信号途径调控瑞氏木霉纤维素酶的表达合成特别地,我们发现TrRas2参与调控了瑞氏木霉纤维素酶的表达合成。敲除TrRas2导致瑞氏木霉纤维素酶表达明显降低并延迟,而持续性激活TrRas2则使得主要纤维素酶基因cbh1和cbh2的表达量相对野生型菌株分别提高73%和128%。虽然持续性激活TrRas2能提高纤维素酶基因的表达量,但是仍然不能改变瑞氏木霉纤维素酶表达对纤维素底物的依赖性,说明TrRas2并不是直接介导了纤维素-纤维素酶表达的信号传递过程。深入的研究发现,主要的纤维素酶基因正调控因子Xyr1作用于TrRas2的下游,而TrRas2通过调节Xyr1的表达量调控了瑞氏木霉纤维素酶基因的表达。另外,TrRas2对纤维素酶负调控因子Acel和Crel的表达有负调控作用,因此TrRas2也可能通过直接或间接调控其他转录因子的表达量调控了纤维素酶基因的表达。虽然有研究表明cAMP信号途径调控了瑞氏木霉纤维素酶表达,而且我们的研究显示TrRas2有升高胞内cAMP含量的作用,但是敲除TrRas2未造成cAMP含量变化却导致纤维素酶表达缺陷的事实表明：TrRas2可能通过提高cAMP含量正向调控了纤维素酶表达,而同时TrRas2（?）还可以通过cAMP信号途径之外的其他途径调控纤维素酶表达。此外,我们的研究结果还排出了TrRas2直接介导光信号调控纤维素酶表达的可能性。另外,通过表达谱测序我们发现TrRas2正占调控了瑞氏木霉大部分木质纤维素降解酶的表达,从而在瑞氏木霉降解木质纤维素的过程中发挥了重要作用。总之,本论文的研究初步阐明了Ras小GTPase对瑞氏木霉形态建成和纤维素酶表达的调控作用及其作用机制,对解释以瑞氏木霉为代表的丝状真菌的高效的木质纤维素降解能力具有重大意义。3.基因工程手段优化瑞氏木霉纤维素酶系为了改良瑞氏木霉纤维素酶系,本论文通过遗传工程的方法在瑞氏木霉中过表达了内源性的β-葡萄糖苷酶。其中,我们使用了本实验室构建的4拷贝cbhl强启动子过表达β-葡萄糖苷酶基因bgll。对酶活力的测定结果显示转化子的p-葡萄糖苷酶活力是出发菌株的1.8-37倍,并且过表达p-葡萄糖昔酶转化子的纤维素酶对木质纤维素底物木糖渣的糖化效率相比出发菌株提高了11-29%。另外,我们在瑞氏木霉中异源表达了来自Trametes sp. AH28-2的木质素降解相关酶漆酶LacA。将漆酶基因lacA置于来源于Aspergillus nidulans的gpdA启动子下游并融合瑞氏木霉的Cbhl的信号肽序列以利于重组漆酶的表达和分泌。活性SDS-PAGE结果显示瑞氏木霉转化子能成功表达并分泌重组漆酶,以ABTS为底物进行测定时漆酶活力能达到3.62IU/ml,而且该重组漆酶的性质与来自Trametes sp.AH28-2的原始漆酶非常接近。漆酶转化子的纤维素酶糖化木糖渣产生葡萄糖的量相比出发菌株提高了30.8-45.3%。上述研究工作为纤维素酶系的基因工程改良进行了有意义的探索,并为利用瑞氏木霉作为宿主对上述两种酶蛋白进行表达生产和应用奠定了基础。