以兔粘液瘤病毒为载体构建兔出血热病毒重组疫苗的研究

论文摘要

兔出血热病毒及兔粘液瘤病毒是严重危害欧洲兔群的两大病毒。兔出血热病（RHD）是由兔出血热病毒（RHDV）引起的一种能够感染家兔和野兔的烈性、致死性传染病,感染个体通常在48至72小时内死亡,对养兔业造成了极大的经济损失,同时引起野兔生存量的极大减少。该病于1984年首次在我国发现并报道,随后世界各地也相继有该病毒的相关报道出现,由于该病毒具有强致死性和高传播性,因此引起了科学界的广泛关注。兔出血热病毒属于杯状病毒科、兔病毒属,基因组长度为7.4Kb的正股单链RNA病毒,病毒衣壳由一个大小为60kDa的蛋白质所组成（VP60）。兔粘液瘤病毒属于痘病毒科、野兔痘病毒属,为双链DNA病毒,病毒基因组长度约为163kb,具有痘病毒的典型特点,在被感染细胞的细胞质内进行复制和装配。兔粘液瘤病毒（MV）对它的自然宿主美洲Sylvilagus兔致病力温和,然而却是欧洲兔的一种致死性病毒。本病只发生于家兔和野兔,其他动物和人类不易感。吸血昆虫如蚊、跳蚤等可为传染媒介。本实验利用兔粘液瘤病毒所具有的痘病毒的特点,将其作为一个病毒载体。首先在体外构建一个重组质粒,在其中插入痘病毒的非必须基因胸腺激酶基因TK,将TK基因分为上游及下游分别插入克隆载体。继而在TK基因之间插入RHDV的结构基因VP60和GFP筛选标记基因及痘病毒启动子。选择一株毒力适宜的MV毒株,感染体外培养的RK13细胞后,将上述重组质粒进行转染,利用同源重组的原理,使野生型MV病毒的TK基因与重组病毒的TK基因区域进行同源重组,利用插入的GFP基因为筛选标记,通过荧光显微镜筛选出重组病毒MV-VP60,该重组病毒可表达RHDV的结构蛋白VP60。并预期此重组病毒能够诱导产生高水平的RHDV和MV特异性抗体。继而通过对家兔进行皮下注射重组病毒MV-RHDV,经吸血昆虫跳蚤等吸血昆虫携带重组病毒,使其在野兔群中进行传播。成功的免疫能够有效地保护野兔群免受兔粘液瘤病及兔出血热病的侵袭。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 前言
• 1.1 兔出血热病毒RHDV介绍
• 1.1.1 兔出血热病毒RHDV的发现
• 1.1.2 兔出血热病毒RHDV的分类及基因组结构
• 1.1.3 兔出血热病毒的检测及研究现状
• 1.2 兔粘液瘤病毒MV介绍
• 1.2.1 兔粘液瘤病毒的感染
• 1.2.2 兔粘液瘤病毒的分类及理化性质
• 1.3 以痘病毒为载体的重组病毒的研究
• 1.4 研究目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 细胞和病毒
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 引物
• 2.1.4 试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 从病毒液中提取病毒DNA
• 2.2.2 大肠杆菌质粒DNA提取
• 2.2.3 大肠杆菌转化
• 2.2.4 DNA体外操作（Kieser T.et al.,1999）
• 2.2.5 琼脂糖凝胶电泳（按分子克隆操作步骤）
• 2.2.6 纯化PCR产物（按分子克隆操作步骤）
• 2.2.7 细胞培养及相关操作
• 第三章 结果与分析
• 3.1 家兔皮下注射试验确定适宜毒力的兔粘液瘤病毒（MV）毒株
• 3.1.1 十种MV毒株的滴度测定
• 3.1.2 家兔皮下注射
• 3.1.3 症状观察
• 3.2 以LAcZ基因为筛选标记筛选重组病毒
• 3.2.1 转染效率的观察
• 3.2.2 重组病毒的筛选及鉴定
• 3.2.3 小结
• 3.3 构建含有绿色荧光蛋白（GFP）筛选标记的重组质粒
• 3.3.1 重叠延伸PCR扩增不同启动子及GFP片段
• 3.3.2 以pMVP60为载体构建含有GFP筛选标记的重组质粒
• 3.4 筛选合适的启动子
• 3.5 重组病毒的筛选
• 3.5.1 重组质粒的转染及转染效率的测定
• 3.5.2 重组病毒的筛选及纯化
• 3.6 重组病毒的鉴定
• 3.6.1 Western-blot验证
• 3.6.2 重组病毒样品的PCR检测
• 第四章 讨论与展望
• 4.1 结果讨论
• 4.2 展望
• 参考文献
• 本文缩写词
• 在读期间发表论文
• 致谢