论文摘要
目的1.建立STZ诱导的糖尿病大鼠模型,观察糖尿病早期,随病程的延长,视网膜组织病理结构及神经细胞超微结构的形态学改变,以及视网膜神经细胞的凋亡情况。2.观察糖尿病大鼠早期,视网膜神经细胞线粒体内抗氧化酶-锰超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase,MnSOD)、细胞浆内铜/锌超氧化物歧化酶(cuproznic superoxide dismutase,Cu/ZnSOD)的活性及基因表达变化,以及凋亡执行分子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的表达变化,并探讨它们与糖尿病早期视网膜神经细胞凋亡的关系,以揭示神经细胞凋亡的发生机制。3.观察褪黑素对糖尿病大鼠早期视网膜MnSOD、Cu/ZnSOD活性及基因表达变化和对caspase-3基因表达及神经细胞凋亡情况的影响,以揭示褪黑素对早期糖尿病视网膜的神经保护作用机制。方法1.一次性腹腔注射STZ诱导糖尿病大鼠模型,于糖尿病4w、8w、12w三个时间点,石蜡切片HE染色观察视网膜组织病理结构改变,透射电镜观察视网膜神经细胞超微结构的变化,原位细胞凋亡(TUNEL)法检测视网膜神经细胞的凋亡情况。2.应用黄嘌呤氧化酶法检测正常对照(CON)细及糖尿病(DM)组视网膜总超氧化物歧化酶(Total superoxide dismutase,T-SOD)及MnSOD、Cu/ZnSOD的活性,SYBR GreenRealtime PCR Master Mix法检测MnSOD mRNA、Cu/ZnSOD mRNA及caspase-3 mRNA的表达情况,免疫组织化学染色法定性及定位检测caspase-3蛋白的表达情况。3.褪黑素(melatonin,Mel)10mg/kg/d每日灌胃干预糖尿病大鼠,于不同时间点,应用上述方法对MnSOD、Cu/ZnSOD活性及基因表达、capase-3基因表达进行检测,TUNEL法进行神经细胞凋亡检测。结果1.随糖尿病大鼠病程延长,逐渐出现视网膜神经节细胞数量减少、细胞排列紊乱的病理改变,透射电镜下可见视网膜神经细胞出现胞浆浓缩、细胞体积缩小、染色质边聚、细胞核固缩、断裂等不同阶段的凋亡征象。细胞凋亡主要发生于视网膜神经节细胞层及内核层,神经细胞程度随病程延长逐渐加重。2.随糖尿病大鼠病程延长,MnSOD、Cu/ZnSOD的活性及基因表达均呈逐渐下降趋势,其活性改变与基因表达变化相一致。糖尿病初期MnSOD变化明显,在发病4w时最为显著,Cu/ZnSOD的变化发生较晚,主要在12w时出现明显下降。Caspase-3免疫组化染色的阳性表达主要位于视网膜神经节细胞层及内核层,其基因表达随病程延长逐渐增强,于4w及8w时变化湿著,12w时变化幅度减轻。3.褪黑素组与同期糖尿病组相比,在不同时间点视网膜MnSOD、Cu/ZnSOD活性及基因表达有不同程度的增强,相反,capsse-3的基因表达及神经细胞凋亡情况则呈不同程度的减弱,褪黑素对MnSOD的影响较早(4w)、程度较强,对caspase-3及神经细胞凋亡的影响发生于8w时,对Cu/ZnSOD的影响最晚发生在12w时。结论1.糖尿病大鼠早期视网膜神经细胞凋亡主要发生于视网膜神经节细胞层及内核层,并随病程延长细胞凋亡逐渐加重。2.糖尿病早期,caspase-3的激活及神经细胞的凋亡随病程延长逐渐增强,同时出现视网膜MnSOD、Cu/ZnSOD的活性下降及基因表达下调,二者可能具有相关性,且早期与MnSOD活性及基因表达变化的关系可能更为密切。3.褪黑素能够通过提高糖尿病大鼠视网膜MnSOD、Cu/ZnSOD的活性及基因表达,减轻caspase-3的激活,从而减少神经细胞凋亡,达到神经保护的目的,褪黑素对MnSOD的影响较Cu/ZnSOD发生时间早、程度强。
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