鸡传染性支气管炎病毒S1基因与鸡IL-18基因在禽痘病毒载体中的共表达

论文摘要

为研究河南IBV的分子流行病学背景,开发有效地新型疫苗。我们从河南省汝州市爆发鸡传染性支管炎（IB）的鸡群中分离出1株病毒。由于我国鸡传染性支气管炎病毒（IBV）不同血清型的出现,对感染异种IBV分离株而发病的鸡群不能提供完全保护作用,这造成了我国免疫鸡群中IB频繁发生的原因之一。禽痘病毒载体疫苗在生产实践中已被证实为一种安全有效的疫苗,部分产品已经投入使用。本研究主要获得重组病毒rFPV-S1和rFPV-S1-ChIL-18,为其免疫效力的研究奠定了基础。根据GenBank中已发表的IBV S1基因,设计并合成了1对引物,采用RT-PCR技术扩增IBV河南分离株（IBV-HN05）S1基因,并进行克隆和测序。结果表明,所克隆的片段大小为1 739 bp,包含S1基因和部分S2基因,S蛋白切割识别位点序列为RRSRR。序列比较分析发现,IBV HN05株S1基因与吉林JAAS株S1基因核苷酸同源性为99.8%,氨基酸同源性为99.3%,而与其它支气管炎病毒株核苷酸同源性为78.1%-84.2%。通过IBV S1基因系统进化分析,结果发现HN05株与JAAS株的亲缘关系最近,而与其它支气管炎病毒株的亲缘关系均较远。为了构建IBV S1基因重组禽痘病毒,将其亚克隆到含有LP2EP2早晚期启动子的载体pSY538的BamHI位点,将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因平端克隆到质粒pSY681的SfiI位点,然后切下S1片段再亚克隆到禽痘病毒载体pSY681的NotI位点,用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得重组病毒rFPV-S1,通过PCR和酶切进行鉴定。结果表明获得包含有IBV S1基因的禽痘病毒并且具有稳定的遗传性状。以间接免疫荧光法证实感染rFPV-S1的CEF中存在表达的S1蛋白,为研发鸡传染性支气管炎病毒重组禽痘病毒疫苗奠定了基础。共表达IBV S1基因与鸡IL-18基因的重组鸡痘病毒的构建,将含有LP2EP2启动子的ChIL-18基因克隆至含有S1基因的重组禽痘病毒rFPV-S1的上游,用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选,获得重组病毒rFPV-S1-ChIL-18,通过PCR和酶切进行鉴定。结果表明获得包含有IBV S1基因和ChIL-18的重组禽痘病毒并且具有稳定的遗传性状。以间接免疫荧光法证实感染rFPV-S1-ChIL-18的CEF中存在表达的S1蛋白;以T细胞转化试验证实感染rFPV-S1-ChIL-18的CEF中能够表达ChIL-18蛋白;抗病毒效价测定表明重组禽痘病毒rFPV-S1-ChIL-18具有抗水泡性口炎病毒活性。为研发鸡IL-18基因和传染性支气管炎保护性抗原基因的重组禽痘病毒疫苗奠定了基础。本研究成功获得了IBV S1基因全序列;成功获得了重组禽痘病毒rFPV-S1并能在CEF中进行真实表达。成功获得了重组禽痘病毒rFPV-S1-ChIL-18,并具有一定的抗病毒活性,能够提高机体的细胞免疫水平。为开发利用鸡IL-18的佐剂效应及构建共表达鸡IL-18基因和保护性抗原基因的重组禽痘病毒疫苗奠定基础。

论文目录

• 摘要
• 文献综述
• 综述一：鸡传染性支气管炎研究进展
• 综述二：白细胞介素18 的研究进展
• 综述三：禽痘病毒载体及其在传染性疾病上的应用
• 试验一 鸡传染性支气管炎病毒HN05 株51 基因的克隆与序列测定
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 试验二 鸡传染性支气管炎病毒HN05 株51 基因重组禽痘病毒的构建
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 试验三 IBV HN05 51 基因和鸡IL-18 基因在禽痘病毒载体中的表达
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 参考文献
• ABSTRACT
• 致谢