猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立及其全基因组克隆与序列分析

论文摘要

根据基因型的不同,参照GeneBank上发表的TTV1（GU570198.1）和TTV2（AY823991.1）的序列,各设计两对巢式引物用于检测TTV1和TTV2。采集生猪血液样品若干份,提取病毒DNA,用巢式PCR技术,扩增出TTV1、TTV2非编码区特异性目的基因片段,将目的片段回收进行克隆测序,以确定为感染TTV1与TTV2病毒。再用阳性TTV DNA为模板,对巢式PCR反应条件进行优化,通过重复性、敏感性、特异性试验来验证该方法的准确性。最后,将优化好的TTV1、TTV2检测方法用于对所采集的127份血清样品进行PCR检测。结果可看出,本研究建立的巢式PCR检测方法重复性、敏感性、特异性较好,适用于临床大规模的检测。针对四川省采集鉴定为TTV1和TTV2阳性的血清样品各两份,参照GeneBank上发表的猪输血性传播病毒1型（TTV1）和2型（TTV2）全基因组核苷酸序列（AB076001.1、GU456386.1）,设计特异性引物,采用巢式PCR的方法扩增TTV1和TTV2全基因组序列,分别进行克隆、测序和拼接,并对其进行遗传进化分析和同源性分析。结果表明,两株TTV1基因组全长分别为2852bp和2917bp；两株TTV2基因组全长分别为为2802bp和2798bp,TTV1-SC1、TTV1-SC2与已公布的TTV1基因组序列相似性分别为81%～95%、82%～94%。TTV2-SC1、TTV2-SC2与已公布的TTV2基因组序列相似性分别为88%-99%、80%-96%。系统进化树分析表明,分离株TTV1-SC1与TTV1 Bj10株（HM633251.1）亲缘关系最近,分离株TTV2-SC2与TTV2SH0822／2008株（GU450331.1）亲缘关系最近,分离株TTV2-SC1、TTV2-SC2与PTTV2c-VA株（GU456386.1）亲缘关系最近。通过对TTV.ORF1蛋白抗原性分析,疏水性分析和二级结构分析,推测TTV1-SC1-ORF1的抗原表位集中在155aa。173aa、409aa-423aa和470aa-497aa这三个区域之间。TTV1-SC2-ORF1的抗原表位集中在46aa-62aa、169aa-175aa和321aa-337aa这三个区域之间。而TTV2两个毒株的一级结构同源性较高,氨基酸的差异并没有影响到蛋白质的抗原性,推测TTV2.SC1-ORF1和TTV2-SC2-ORF1的抗原表位都集中在268aa-279aa、379aa-390aa、505aa-511aa和517aa-533aa这四个区域之间,这些分析结果是否能说明此区域就是真正的抗原表位,还需实验证实。本研究有利于监测猪TTV1与TTV2的疫源和进化情况,为进一步深入研究病毒形态结构、遗传与变异和基因功能特点奠定一定的生物学基础。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 第一章 输血性传播病毒的研究进展
• 1 病原学
• 1.1 TTV的理化性质
• 1.2 TTV DNA的结构和功能
• 1.3 TTV的分型
• 2 流行病学
• 2.1 人的TTV感染
• 2.2 灵长类动物的TTV感染
• 2.3 猪的TTV感染
• 3 致病性
• 4 检测方法
• 4.1 TTV分子生物学的检测方法
• 4.2 TTV分型的检测
• 4.3 TTV的其他检测方法
• 4.3.1 血清免疫学法
• 4.3.2 原位杂交法
• 5 本研究的目的和意义
• 第二章 猪输血性传播病毒1型和2型PCR检测方法的建立
• 前言
• 1 材料
• 1.1 病料与载体
• 1.2 主要试剂及溶液配制
• 1.2.1 主要试剂
• 1.3 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 PCR引物的设计
• 2.2 病毒总DNA的抽提
• 2.3 PCR扩增
• 2.4 目的基因的克隆
• 2.4.1 PCR产物目的DNA片段的回收
• 2.4.2 连接
• 2.4.3 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
• 2.4.4 重组质粒的转化
• 2.5 阳性菌的鉴定
• 2.6 目的基因的序列测定
• 2.7 PCR扩增条件的优化
• 2.8 特异性实验
• 2.9 敏感性实验
• 2.10 重复性实验
• 2.11 TTV1、TTV2 PCR检测方法的临床应用
• 3 实验结果与分析
• 3.1 病料PCR扩增产物电泳结果
• 3.2 特异性试验鉴定结果
• 3.3 敏感性试验鉴定结果
• 3.4 重复性试验鉴定结果
• 3.5 PCR的临床应用的鉴定结果
• 3.5.1 采用PCR进行检测
• 3.5.2 TTV1、TTV2的感染情况
• 4 讨论
• 4.1 关于引物设计
• 4.2 关于TTV1、TTV2病毒的确定
• 4.3 关于敏感性试验、特异性试验和重复性试验
• 4.4 关于PCR方法的临床应用
• 第三章 猪输血性传播病毒1型（TTV1）和2型（TTV2）全基因组的克隆与序列分析
• 前言
• 1 材料
• 1.1 试剂与仪器
• 1.2 病料
• 2 方法
• 2.1 TTV1与TTV2全基因组的克隆
• 2.1.1 病毒基因组DNA的提取
• 2.1.2 TTV1与TTV2全基因组的PCR扩增
• 2.1.3 PCR产物的克隆与序列测定
• 2.2 TTV1和TTV2全基因组的生物信息学分析
• 2.2.1 TTV1和TTV2基因组核苷酸序列同源性分析和进化树分析
• 2.2.2 TTV1和TTV2基因组核苷酸重复高变序列分析
• 2.3 TTV1和TTV2 ORF1蛋白结构与功能预测
• 2.3.1 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白抗原性预测分析
• 2.3.2 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白疏水性分析
• 2.3.3 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白二级结构预测
• 2.3.4 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白亚细胞定位预测
• 3 结果与分析
• 3.1 TTV1、TTV2全基因组的PCR扩增
• 3.2 PCR产物的克隆及测序
• 3.3 TTV1、TTV2全基因组序列的拼接
• 3.4 TTV1、TTV2全基因组的序列分析
• 3.4.1 TTV1、TTV2全基因组同源性分析与进化树
• 3.4.2 TTV1、TTV2基因组核苷酸高变缺失序列分析
• 3.5 TTV1、TTV2 ORF1蛋白结构与功能预测
• 3.5.1 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白抗原性分析
• 3.5.2 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白疏水性分析
• 3.5.3 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白的二级结构预测
• 3.5.4 TTV1-ORF1、TTV2-ORF1蛋白亚细胞定位预测
• 3 讨论
• 3.1 关于全基因组克隆
• 3.2 关于序列分析
• 3.3 关于ORF1蛋白分析
• 结论
• 1 TTV1和TTV2 PCR检测方法的建立
• 2 TTV1与TTV2全基因组克隆与序列分析
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录一 TTV1和TTV2全基因组测序结果