草鱼肝脏型脂肪酸结合蛋白基因克隆及原核表达

论文摘要

肝脏型脂肪酸结合蛋白（liver-type fatty acid-binding protein,L-FABP）属于脂肪酸结核蛋白家族一员,为一族小分子蛋白质,对长链脂肪酸有很高的亲和力,能把脂肪酸从细胞膜转运到氧化和合成的部位,在长链脂肪酸的代谢中发挥着非常重要的作用。本文运用RACE（rapid amplification of cDNA ends）-PCR方法扩增出草鱼肝脏型脂肪酸结合蛋白基因的全长cDNA,其全长为487 bp,包含5′端非编码区55 bp,3′端非编码区51 bp,开放阅读框381 bp。草鱼脂肪酸结合蛋白的开放阅读框编码126个氨基酸。半定量RT-PCR结果显示草鱼L-FABP mRNA主要在肝脏、脾脏、后肠中表达,在头肾、后肾、心脏、前肠表大量较少,在中肠、肌肉和腮中几乎不表达。根据草鱼L-FABP的cDNA序列设计含有酶切位点的引物,将草鱼L-FABP完整开放阅读框克隆到原核融合表达载体pET-32a（+）上,测序鉴定后,将重组表达质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中用IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE电泳分析显示重组融合蛋白在分子量约33 kDa左右处有明显表达带,与预期分子量大小一致,光密度分析,目的蛋白约占总表达蛋白的49.5%。这一研究成果为进一步研究脂肪酸结合蛋白生物学特性以及脂肪酸结合蛋白基因对脂肪代谢调控规律奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 目录
• 第一章 脂肪酸结合蛋白研究进展
• 1 FABP类型、分布及结构特点
• 1.1 H-FABP组织分布与结构特点
• 1.2 A-FABP组织分布与结构特点
• 1.3 L-FABP的组织分布与结构特点
• 1.4 脂肪酸结合蛋白的基因
• 2 脂肪酸结合蛋白的生物学功能
• 2.1 FABP与体内脂肪酸的转运
• 2.2 FABP对脂肪酸摄取的影响
• 3 FABP调节脂肪酸代谢机制
• 3.1 调节细胞内脂肪酸的浓度,调控多种细胞内的生化反应过程
• 3.2 FABP与脂肪酸代谢酶
• 3.3 FABP基因的脂肪酸调控
• 4 本研究的目的和意义
• 第二章 草鱼肝脏型脂肪酸结合蛋白基因CDNA全长克隆、组织表达及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 实验动物与菌株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器设备
• 1.1.4 引物
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 动物材料处理
• 1.2.2 总RNA的提取
• 1.2.3 mRNA的分离纯化
• 1.2.4 SMART cDNA的合成
• 1.2.5 草鱼Liver fatty-acid binding protein（FABP）cDNA片段的获得
• 1.2.6 PCR产物的鉴定和胶回收
• 1.2.7 感受态细胞的制备
• 1.2.8 目的片断的连接和转化
• 1.2.9 序列分析
• 1.2.10 系统发育树的构建
• 1.2.11 L-FABP基因的RT-PCR分析
• 2 结果与分析
• 2.1 草鱼肝胰脏总RNA的提取
• 2.2 草鱼L-FABP基因cDNA全长序列拼接及序列分析
• 2.2.1 草鱼L-FABP基因cDNA全长的获得
• 2.2.2 L-FABP基因编码氨基酸序列结构分析及信号肽预测
• 2.2.3 草鱼L-FABP氨基酸序列的跨膜结构、二硫键和三级结构预测
• 2.2.4 草鱼L-FABP氨基酸序列与其他物种的同源性比较
• 2.2.5 系统发育分析
• 2.3 草鱼L-FABP基因的组织差异表达分析
• 3 讨论
• 3.1 肝脏型脂肪酸结合蛋白基因序列的基本特征
• 3.2 草鱼L-FABP基因在不同组织中的表达
• 3.3 RACE扩增L-FABP全长基因
• 第三章 草鱼L-FABP基因的原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要仪器设备
• 1.1.2 菌种及载体
• 1.1.3 酶制剂及化学试剂
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 原核表达载体的构建及质粒重组
• 1.2.1.1 草鱼肝脏总RNA提取及cDNA第一链的合成
• 1.2.1.2 草鱼L-FABP基因开放阅读框（Opening Reading Fram）区域的扩增及胶回收
• 1.2.1.3 原核表达载体质粒DNA的小量提取
• 1.2.1.4 带粘性末端L-FABP基因及载体的制备
• 1.2.1.5 L-FABP基因与原核表达载体的连接与转化
• 1.2.2 重组质粒的诱导表达及SDS-PAGE鉴定
• 2 实验结果
• 2.1 草鱼L-FABP基因开放阅读框（OPEN READING FRAME,ORF）扩增
• 2.2 草鱼L-FABP基因重组表达质粒构建和鉴定
• 2.3 草鱼L-FABP基因开放阅读框（OPEN READING FRAME,ORF）片段测序鉴定
• 2.4 表达产物的SDS-PAGE电泳检测
• 3 讨论
• 3.1 表达载体的选择、诱导条件及重组蛋白的表达形式
• 3.2 脂肪酸结合蛋白原核表达载体构建及融合蛋白表达
• 3.3 脂肪酸结合蛋白原核表达研究展望
• 结论
• 参考文献
• 附录
• 1.各种缓冲液及培养基的配置方法
• 2.测序图谱（部分）
• 3.GENE BANK提交的肝脏型脂肪酸结合蛋白cDNA全长序列
• 致谢
• 作者简介