重组猪圆环病毒2型/白介素-2核酸疫苗的构建及免疫效果研究

论文摘要

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）是引发猪断奶后多系统衰竭综合征的主要病原。PCV2主要由ORF1和ORF2构成,ORF2基因是PCV2的重要抗原基因,编码病毒的衣壳蛋白（Cap蛋白）,在Cap蛋白上存在抗原表位,具有免疫原性,因此ORF2基因成为建立PCV2特异性血清学检测方法及核酸疫苗研究的目的基因。当前国内外尚没有PCV2疫苗可用,因此研制猪圆环病毒2型核酸疫苗对控制猪PCV2病的发生具有重要意义。设计含双酶切位点的引物采用PCR方法扩增PCV2的ORF2全长基因并克隆入pGEM-T easy克隆载体;采用重叠延伸PCR（splicing by overlap extension-PCR,SOE-PCR）技术将PCV2的ORF2全长基因和猪白介素2成熟肽基因（ PoIL-2 ）构建成重组嵌合基因（PCV2-linker-PoIL-2）并克隆入pGEM-T easy克隆载体;筛选含PCV2-linker-PoIL-2、PCV2 ORF2的阳性克隆质粒经限制性内切酶双切后连接入经相同酶切的pcDNA3.1（+）真核表达载体中以构建重组表达质粒（rpcDNA3.1/ PCV2-linker-PoIL-2、rpcDNA3.1/ORF2）。筛选阳性重组表达质粒rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2、rpcDNA3.1/ORF2瞬时转染COS-7细胞,分别采用PCV2抗原间接免疫荧光试验和PoIL-2蛋白ELISA试验方法检测COS-7细胞中表达的重组融合蛋白（rCap-linker-PoIL-2、rCap ）免疫反应活性;提取rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒和rpcDNA3.1-OFR2质粒分别对Balb/c小鼠和猪进行三次免疫,采用PCV2抗体ELISA检测方法以评价其免疫效果。结果表明:成功构建了单重组表达质粒pcDNA3.1/OFR2和PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因及其共表达质粒rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2 ; rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2和rpcDNA3.1/OFR2质粒在COS-7细胞浆内进行了表达,表达的rCap-linker-PoIL-2蛋白可分别与抗PCV2和抗PoIL-2蛋白抗血清发生特异性免疫反应,表明rCap-linker-PoIL-2蛋白具有Cap蛋白和PoIL-2蛋白的双重免疫反应活性。rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒免疫小鼠后可诱导小鼠产生明显的抗PCV2抗体,第3次加强免疫后,免疫组抗体滴度最高是空白对照组的3.2倍,且显著高于rpcDNA3.1/OFR2质粒对照组; rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2和rpcDNA3.1/ORF2质粒均可诱导猪体产生抗PCV2免疫应答,rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2、rpcDNA3.1/ORF2质粒免疫组抗体滴度分别是空载体对照组的12.46倍、10.13倍,表明PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因中的PoIL-2对rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒在小鼠体内的免疫起到了很好的免疫增强作用。本研究成功构建了PCV2-linker-PoIL-2嵌合基因及其重组表达质粒pcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2;重组表达质粒在COS-7细胞中表达了具有Cap蛋白和PoIL-2蛋白双重免疫反应活性的融合蛋白,免疫小鼠和猪后可诱导小鼠和猪产生高的抗PCV2抗体,且其诱导的抗体水平明显高于pcDNA3.1/OFR2重组质粒。本研究为PCV2的DNA疫苗研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• 文献综述
• 1 猪圆环病毒研究进展
• 1.1 病原学
• 1.1.1 病毒的发现
• 1.1.2 理化特性
• 1.1.3 病毒的培养特性
• 1.1.4 复制动力学
• 1.1.5 病毒基因组
• 1.1.6 复制与转录
• 1.1.7 主要结构蛋白
• 1.1.8 PCV2 疫苗的研究现状
• 1.2 流行病学
• 1.2.1 流行情况
• 1.2.2 致病机理
• 1.2.3 病理变化
• 1.3 诊断与防制
• 1.3.1 诊断
• 1.3.2 防制
• 2 白介素-2 研究进展
• 2.1 白介素-2 的发现与命名
• 2.2 IL-2 受体（IL-2R）的结构及特性
• 2.3 IL-2 的种属特异性
• 2.4 IL-2 的生物学活性
• 2.4.1 刺激T 细胞生长
• 2.4.2 诱导细胞毒作用
• 2.4.5 对 B 细胞的作用
• 2.4.6 对巨噬细胞的作用
• 2.5 IL-2 的应用
• 2.5.1 免疫治疗剂
• 2.5.2 作为免疫增强剂
• 2.5.3 构建新型基因工程疫苗
• 引言
• 试验一 PCV2-LINKER-POIL-2 嵌合基因及其真核表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细胞株和质粒
• 1.1.2 主要试剂和试剂盒
• 1.1.3 主要溶液的配制
• 1.1.3.1 质粒 DNA 提取用溶液
• 1.1.3.2 大肠杆菌培养用溶液
• 1.1.3.3 琼脂糖电泳凝胶用溶液
• 1.1.3.4 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 单表达 Cap 蛋白pcDNA3.1/ORF2 重组表达质粒的构建
• 1.2.1.1 PCV2 ORF2 基因的扩增
• 1.2.1.2 PCV2 ORF 基因的回收
• 1.2.1.3 PCV2 ORF2 基因与pGEM-T Easy Vector 的连接
• 1.2.1.4 连接产物的转化
• 1.2.1.5 挑斑
• 1.2.1.6 重组质粒 DNA 的小量制备—碱裂解法
• 1.2.1.7 克隆质粒的鉴定
• 1.2.1.8 单表质粒pcDNA3.1/ORF2 的构建
• 1.2.2 共表达 Cap 蛋白和 PoIL-2 蛋白嵌合基因 PCV2-linker-PoIL-2 的构建
• 1.2.2.1 PCV2 ORF2 和 POIL-2 基因的扩增
• 1.2.2.2 PCV2 ORF2 基因的扩增
• 1.2.2.3 POIL-2 基因的扩增
• 1.2.2.4 通过 SOE-PCR 构建 PCV2-linker-PoIL-2 嵌合基因
• 1.2.2.5 克隆质粒pT/PCV2-linker-PoIL-2 的构建及鉴定
• 1.2.2.6 共表达重组质粒 pcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2（rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2）的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 单表达 CAP 蛋白 PCDNA3.1/ORF2 重组表达质粒的鉴定
• 2.2 通过 SOE-PCR 构建 PCV2-LINKER-POIL2 嵌合基因的鉴定
• 2.3 PCDNA3.1/PCV2-LINKER-POIL2 重组表达质粒的构建及鉴定
• 3 讨论与结论
• 试验二 RPCDNA3.1/PCV2-LINKER-POIL-2 质粒在 COS-7 细胞中的表达及鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细胞株和质粒
• 1.1.2 主要试剂和试剂盒
• 1.1.3 主要溶液的配制
• 1.1.3.1 细胞培养用溶液
• 1.1.3.2 大肠杆菌培养用溶液
• 1.1.3.3 琼脂糖电泳凝胶用溶液
• 1.1.4 主要仪器设备
• 1.2 方法
• 1.2.1 无内毒素重组质粒pcDNA3.1/ORF2、pcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2 及空质粒 pcDNA3.1（＋）的提取
• 1.2.2 重组质粒瞬时转染 COS-7 细胞
• 1.2.3 表达产物的鉴定
• 1.2.3.1 间接免疫荧光（IFA）检测重组质粒表达的 Cap 蛋白
• 1.2.3.2 ELISA 方法检测rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2 表达的 PoIL-2 蛋白
• 2 结果与分析
• 2.1 去内毒素重组质粒浓度
• 2.2 间接免疫荧光（IFA）方法检测 COS-7 细胞中表达的重组融合蛋白中 CAP 蛋白活性
• 2.3 间接 ELISA 检测 COS-7 细胞中表达的重组融合蛋白中 POIL-2 蛋白活性
• 3 讨论与结论
• 试验三 RPCDNA3.1/PCV2-LINKER-POIL2 质粒在小鼠和猪体内的免疫效果研究
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 试验动物
• 1.1.2 质粒和细菌
• 1.1.3 主要试剂
• 1.1.4 大量提取质粒及纯化所需溶液
• 1.2 方法
• 1.2.1 重组质粒的大量提取及纯化
• 1.2.2 rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2 质粒免疫小鼠试验
• 1.2.3 rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2 质粒免疫猪试验
• 1.2.4 ELISA 检测 Balb/c 小鼠和猪血清中 PCV2 抗体水平
• 2 结果与分析
• 2.1 两个重组质粒及空质粒的浓度
• 2.2 PCR 和双酶切鉴定大量提重组质粒
• 2.3 ELISA 检测 BALB/C小鼠血清中 PCV2 抗体
• 2.4 ELISA 检测猪血清中 PCV2 抗体
• 3 讨论与结论
• 创新点
• 参考文献
• ABSTRACT