羊促乳素单克隆抗体的制备和鉴定

论文摘要

促乳素(prolactin, PRL)为腺垂体促乳素细胞分泌的肽类激素,在人类和动物生殖中主要生理作用为促进乳腺发育、启动泌乳和维持泌乳。在家畜,尤其是在羊的繁殖生产中,产后生理性的高促乳素水平会抑制卵巢功能,表现为卵巢上无卵泡发育和排卵,而使母羊产后哺乳期间不能配种妊娠,从而使羊的产羔间隔延长。在肉羊生产中,提高养殖效益的最有效的途径之一就是尽可能地缩短母羊产羔间隔。而缩短产羔间隔最有效的措施,就是在早期断奶和改善母羊营养状况等措施的基础上,尽快降低母羊促乳素水平、恢复卵巢活动。已有研究者采用溴隐亭有效降低促乳素水平,促进母羊卵巢功能的恢复和发情。快速降低母羊体内促乳素分泌的另一条途径就是使用促乳素多克隆或单克隆抗体。利用羊促乳素纯品和Freund佐剂作为免疫原,采用常规的免疫程序,间接ELISA检测结果显示,分别在第1天,15天和29天免疫三次后,血清抗体效价1:8 000~1:10 000之间,表明抗原的免疫原性很好,第四次加强免疫后3 d,脾细胞可用于细胞融合。为了筛选分泌抗体的阳性杂交瘤细胞,以促乳素免疫过的BALB/C小鼠血清为阳性对照,以未免疫的BALB/C小鼠血清为阴性对照,通过对ELISA检测条件的优化,建立了检测羊促乳素抗体的间接ELISA检测方法,其主要条件如下:pH9.6,0.05 mol/L的碳酸盐缓冲溶液(CBS)为包被液,0.1μg/mL的抗原为包被抗原,1% BSA为封闭液,1:200为血清的最佳稀释倍数,1:10 000.为酶标二抗最佳工作浓度,90 min为酶标二抗作用时间,30 min为底物作用时间.。试验证明本法特异性强,有较好的重复性。用该法对促乳素免疫小鼠的血清抗体及其杂交瘤细胞单抗上清进行检测。以1 mL 40%聚乙二醇4 000(PEG 4 000)为融合剂,选用对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按照1:5~1:10的比例在室温下进行融合,整个融合过程控制在1 min,尽量保持匀速,然后在3 min内用基础培养液8 mL稀释PEG,速度为先慢后快,使其失去促融作用,离心,洗涤后,融合后的细胞用HAT选择性培养基培养,融合后每3 d~4 d半量换液一次,在融合后第3天出现小的克隆,第7天杂交瘤细胞铺满孔底50%,用建立的间接ELISA法筛选阳性孔,克隆率为69%,阳性克隆率为23%。阳性培养孔筛选结束后,采用有限稀释法筛选阳性克隆,通过诱生腹水法制备单克隆抗体,并用核型分析对杂交瘤细胞的染色体进行初步鉴定。通过细胞融合,获得五株能稳定分泌抗促乳素特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为AA5B1,AB6C8,BB3C1 , CA6E4 , CE2H6。其细胞上清效价为1:100~1:500 ,腹水效价为1:10000~1:40000,核型分析图谱显示五株杂交瘤细胞染色体数均在92~103之间,证明是SP/20和脾细胞融合产生的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞株冻存5个月后复苏培养,连续传代16代后,仍具有稳定地的分泌抗体的能力。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 综述部分
• 第一章 促乳素及单克隆抗体的研究进展
• 1.1 促乳素及其类似物的研究进展
• 1.1.1 促乳素的发现
• 1.1.2 促乳素的生理特征
• 1.1.3 PRL 的化学和分子生物学及分子结构特征
• 1.1.4 PRL 分泌的生理和病理
• 1.1.5 垂体外组织的PRL
• 1.1.6 下丘脑对PRL 分泌的调节
• 1.1.7 影响PRL 分泌的其他因素
• 1.1.8 PRL 的生物学作用
• 1.1.9 促乳素在兽医相关领域的应用
• 1.2 单克隆抗体技术的研究进展
• 1.2.1 单克隆抗体的在生物学领域的应用
• 1.2.2 单克隆抗体的研究趋势
• 1.2.3 目前临床前研究的单抗及在人类疾病治疗中的作用
• 1.2.4 用于检测药物毒物残留的单克隆抗体的研究
• 试验部分
• 第二章 间接ELISA 法检测羊促乳素抗体方法的建立
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 主要试剂
• 2.1.2 仪器设备
• 2.1.3 试验动物
• 2.1.4 试验方法
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 酶标二抗的工作浓度
• 2.2.2 抗原的最佳包被浓度和血清的最佳稀释倍数
• 2.2.3 封闭条件的选择
• 2.2.4 酶标二抗作用时间的选择
• 2.2.5 底物作用时间的选择
• 2.2.6 终止液浓度
• 2.2.7 筛选出的阳性株
• 2.3 讨论
• 2.3.1 ELISA 操作中的影响因素
• 2.3.2 血清的处理
• 2.3.3 酶标抗体的工作浓度
• 2.3.4 温育的时间
• 2.3.5 洗板
• 2.3.6 底物
• 2.4 小结
• 第三章 抗PRL 杂交瘤细胞株的建立
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 主要试剂
• 3.1.2 主要仪器设备
• 3.1.3 实验动物及细胞
• 3.1.4 液体的配制
• 3.1.5 试验方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 免疫脾细胞的制备
• 3.2.2 骨髓瘤细胞的制备
• 3.2.3 饲养层细胞的制备
• 3.2.4 细胞融合率及阳性杂交瘤细胞的筛选
• 3.2.5 杂交瘤细胞的形态观察
• 3.2.6 分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株的建立
• 3.3 讨论
• 3.3.1 免疫脾细胞采集方法的选择
• 3.3.2 细胞融合过程
• 3.3.3 SP2/0 骨髓瘤细胞的生长状态
• 3.3.4 饲养层细胞的贴壁性
• 3.3.5 融合前的加强免疫
• 3.3.6 融合剂的选择
• 3.3.7 培养基的选择和改变
• 3.3.8 克隆和筛选
• 3.3.9 杂交瘤不生长和死亡
• 3.4 小结
• 第四章 抗PRL 单克隆抗体的制备及鉴定
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 主要试剂
• 4.1.2 主要仪器设备
• 4.1.3 试验动物及细胞
• 4.1.4 试验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 杂交瘤细胞株稳定性鉴定
• 4.2.2 抗 PRL 单克隆抗体杂交瘤上清和腹水单抗效价的测定
• 4.2.3 杂交瘤细胞染色体数
• 4.3 讨论
• 4.3.1 单克隆抗体制备方法的选择
• 4.3.2 单抗的类型与免疫剂量
• 4.3.3 单克隆抗体性质的分析
• 4.4 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介