北极深海沉积物中细菌多样性的研究

论文摘要

北极是一个重要的微生物资源库,特别是在其海水、海冰、海底沉积物中存在着各种类型的微生物。这些微生物不仅在地球整个生态循环的过程中担当了极为重要的角色,也大大增加了极区微生物资源的多样性。北极气候寒冷,降水量极小,大部分地区被冰雪所覆盖,自然环境恶劣,生存于其中的微生物因而也具备了独特的生物学特性。北极深海沉积物16S rDNA基因PCR-DGGE分析,不仅有助于人类进一步了解极地海洋沉积物细菌多样性,而且将为人类合理发掘极地微生物资源提供理论依据。本论文首先对溶菌酶-SDS-蛋白酶K法、SDS-PVP法、微波法、蛋白酶K-CTAB法和TENP法等5种方法提取北极深海沉积物宏基因组DNA进行了比较；并对沉积物宏基因组中16S rDNA基因PCR扩增相关的引物序列、引物浓度、退火温度和模板稀释度等条件,以及PCR产物的变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophresis, DGGE）的聚丙烯酰胺凝胶浓度、变性剂浓度梯度进行了优化。在此基础上本研究对2008年7月到2008年9月期间中国第3次北极科学考察期间在白令海、白令海峡、楚科奇海、楚科奇海峡、加拿大海盆等海区采集的北极深海沉积物进行了16S rDNA基因PCR-DGGE分析,对5个站位PCR-DGGE特征条带进行了克隆和测序,并对这些序列进行了系统进化分析。结果表明5种方法均能从1g北极深海沉积物提取得到10μg以上大小约23kb的细菌基因组总DNA片段。其中溶菌酶-SDS-蛋白酶K法产量最高,TENP法次之；蛋白酶K-CTAB法提取的核酸纯度最高,OD260/OD280, TENP法次之。根据优化,16S rDNA基因采用341F/907R、引物浓度0.4gM、退火温度54℃和模板50×稀释条件进行PCR扩增；16S rDNA基因PCR扩增产物使用浓度梯度40%-55%变性剂、6%的聚丙烯酰胺凝胶进行DGGE。对13个站位北极深海表层沉积物进行16S rDNA基因PCR-DGGE结果显示,R01、R07、R09、R15、R17、C13、C15、C19、C23和BR07等10个站位分离产生的可辨条带数相对较多,而BR02、B86和BS12等3站位沉积物分离产生的可辨条带数相对较少。对从S24,M07,C19等几个站位采集的北极深海沉积物柱式样品的16S rDNA基因PCR-DGGE结果显示,每个柱式站位沉积物中都存在丰富的细菌种类和多种优势种,而且不同站位的的沉积物中细菌总DNA经PCR扩增后进行DGGE电泳,能得到较为清晰可辨的电泳条带并且条带在凝胶上所出的位置不尽相同,不仅是不同站位之间的图谱不同,同一站位不同层次的图谱也不尽相同。对R01、R15、R17、C13和C19等5个站位的16S rDNA基因PCR-DGGE特征条带进行了克隆,挑取31个克隆测定了基因序列。序列分析显示,5个站位中非培养性细菌（Uncultured bactrium）占主要优势（占全部克隆的74.2%）,归属于5个细菌类群：α-变形细菌（a-Proteobacteria,占全部克隆子的48.1%）、β-变形细菌（p-Proteobacteria,占全部克隆子的48.1%）、γ-变形细菌（y-Proteobacteria,占全部克隆子的48.1%）、6-变形细菌（8-Proteobacteria,占全部克隆子的48.1%）、放线细菌（Actinobacteria,占3.2%）,y-Proteobacteria是明显的优势类群。a-Proteobacteria含括了叶杆菌属（Phyllobacterium）、瘤菌属（Rhizobium）、红杆菌属（Rhodobacter）,分布较广,在C13、C19、R07、R15等4个站位海洋沉积物中均发现。8-Proteobacteria只在R01、p-Proteobacteria只在C19、y-Proteobacteria只在C13、放线细菌只在R17检测到。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1 北极概况
• 1.1 北极的生态环境特点
• 1.2 资源的开发和利用概况
• 1.3 北极微生物学研究概况
• 2 深海沉积物中微生物的研究方法与研究现状
• 2.1 微生物分子生态学研究方法
• 2.2 深海沉积物中微生物的研究现状
• 3 深海沉积物中微生物多样性的研究的发展前景
• 3.1 深海微生物多样性
• 3.2 极地沉积物中微生物的研究进展及前景
• 4 本研究的目的及意义
• 第二章 沉积物宏基因组DNA提取及PCR-DGGE条件优化
• 1 材料与方法
• 1.1 北极深海沉积物
• 1.2 主要试剂配方
• 1.3 北极深海沉积物微生物总DNA提取
• 1.4 沉积物宏基因组DNA纯化
• 1.5 沉积物微生物16SrDNA基因PCR扩增
• 1.6 选择DGGE条件
• 2 结果与分析
• 2.1 沉积物总DNA提取方法的比较
• 2.2 最佳PCR退火温度
• 2.3 最佳引物浓度
• 2.4 最佳PCR稀释模板浓度
• 2.5 最佳DGGE胶中变性剂浓度
• 2.6 DGGE电泳时间
• 2.7 DGGE胶的染色
• 3 讨论
• 3.1 深海沉积物微生物总DNA的提取质量
• 3.2 环境样品微生物DNA的纯化
• 3.3 PCR条件优化
• 3.4 DGGE条件的优化
• 第三章 北极深海沉积物微生物多样性的DGGE分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 沉积物微生物总DNA的提取纯化
• 1.3 16SrDNA基因PCR扩增
• 1.4 16SrDNA基因PCR产物DGGE检测
• 1.5 优势条带的回收及PCR扩增
• 1.6 回收条带的克隆
• 1.7 感受态细胞的制备
• 1.8 PCR产物的连接转化
• 1.9 质粒DNA提取
• 1.10 阳性克隆的鉴定
• 1.11 16SrDNA V3-V5区的PCR扩增及DGGE再鉴定确定位置
• 1.12 甘油菌的制备及测序
• 1.13 序列分析
• 1.14 聚类分析及进化数的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 表层沉积物总DNA提取及特异性扩增
• 2.2 柱式沉积物总DNA提取及特异性扩增
• 2.3 表层沉积物细菌DGGE图谱
• 2.4 同一站位不同深度沉积物细菌DGGE图谱
• 2.5 酶切图谱
• 2.6 五个站位表层沉积物中细菌16S rDNA序列系统发育分析
• 3 关于表层沉积物结果的讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢