抗烟曲霉GM抗体在侵袭性曲霉感染诊断的实验及临床研究

论文摘要

近20年来，临床上随着免疫缺陷宿主的不断增多，真菌感染，特别是深部真菌感染不断上升，侵袭性真菌感染是深部真菌病中危害最大的一类，常发生于免疫功能低下的患者，是医院感染常见的类型之一。在侵袭性真菌感染中，曲霉已成为临床上仅次于念珠菌的重要致病菌。是引起免疫抑制患者严重深部真菌感染的重要病原菌。恶性肿瘤、粒细胞减少或粒细胞功能障碍、糖皮质类固醇、免疫抑制剂的使用等原因造成的免疫功能低下患者，是侵袭性曲霉病(IA)发病的高危人群。当免疫功能低下患者吸入曲霉菌孢子后，孢子经气管、支气管、肺泡侵入肺部造成初发的侵袭性感染，并常伴有远隔器官的播散。近10年来，IA发病率不断上升，并成为免疫功能低下患者死亡的主要原因之一。侵袭性曲霉病临床表现多样化，病情进展快，常危及患者的生命，病死率在56—88.1％。早期快速诊断有助于及时控制病情，改善预后。传统的曲霉感染诊断方法依赖于常规真菌分离培养和组织病理签定，真菌分离培养方法所需时间长，阳性率低，而且常因污染造成假阳性，组织病理检查有较高的诊断价值，但因其为有创性，组织取材困难，难以满足临床需要。故探索敏感、特异的早期快速诊断方法是侵袭性真菌感染实验诊断研究领域的热点和难点。当曲霉感染机体时，其菌体成分作为抗原释放于体液中并刺激机体产生特异性抗体，检测曲霉菌特异性抗原和抗体将有助于诊断。由于曲霉菌感染的患者本身常常存在严重免疫抑制，无法产生足够浓度的抗体，且抗体的产生需要一定时间，律往在起病2周后才逐渐升高，早期诊断受到限制。此外，因曲霉菌在自然界中广泛存在，人体皮肤、消化道和呼吸道等与外界相通的部位和器官中可存在曲霉菌暂居或定植，机体不同程度存在抗曲霉菌的抗体，因而特异性抗曲霉菌抗体阳性并不能完全证明机体存在曲霉菌感染。因此，近年来人们把目光投向了灵敏、特异、快速曲霉菌抗原的检测上。半乳糖甘露聚糖(galactomannan，GM)是曲霉菌细胞壁抗原成分，其半乳糖和甘露糖之比为1：1.17，分子量在25000到75000之间，抗原表位位于末端的半乳呋喃糖，每个GM上有十几个半乳呋喃糖表位。烟曲霉是引起侵袭性曲霉感染中最常见而且致病性最强的菌种，占曲霉感染的90％以上，本研究通过提取烟曲霉细胞壁GM抗原成分，制备抗烟曲霉GM单克隆抗体，建立双抗体夹心ELISA检测法，测定血清曲霉菌GM抗原；应用免疫酶组织化学染色方法，检测组织中曲霉菌抗原，以期建立一种能够早期、快速、敏感、特异、可供临床广泛开展的曲霉菌抗原检测方法。我们进行了如下研究：1、制备烟曲霉GM单克隆抗体(GM—McAb)，建立双抗体夹心ELISA法检测烟曲霉GM抗原。2、建立侵袭性曲霉菌感染动物模型，用双抗体夹心ELISA法，检测感染动物血清标本中烟曲霉GM抗原；用免疫酶组织化学方法检测组织中烟曲霉GM抗原，验证和评价烟曲霉GM单克隆抗体在烟曲霉感染动物模型中的抗原诊断价值。3、用烟曲霉GM单克隆抗体进行双抗体夹心ELISA检测临床侵袭性曲霉感染高危患者血清，评价烟曲霉GM单克隆抗体检测技术在临床侵袭性曲霉菌感染诊断中的应用价值。第一部分抗烟曲霉GM单克隆抗体的制备及鉴定烟曲霉培养扩增，提取烟曲霉GM抗原成分，免疫BALB／c小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，建立杂交瘤细胞株，最终得到8A2A17、7E11A1、9D47A1、2D27A6，4株可稳定分泌抗烟曲霉单抗的杂交瘤细胞株。免疫荧光检测抗体效价，8A2A17、7E11A1、9D47A1可达1：32000，而2D27A6仅达1：2000。4株单抗亚类鉴定：8A2A17为IgG1，7E11A1、9D47A1、2D27A6为IgG3单克隆抗体的免疫荧光检测显示，4株单抗均与天然烟曲霉抗原反应，可与烟曲霉涂片中的菌丝及孢子结合，发出黄绿色荧光。免疫荧光法检测烟曲霉单克隆抗体与其他几种曲霉菌的交叉反应，结果显示4株烟曲霉单抗与黄曲霉、土曲霉、黑曲霉之间有交叉反应，这与曲霉菌属之间存有共同的细胞壁抗原成分有关。交叉反应提示，抗烟曲霉GM单克隆抗体不仅能够特异地识别烟曲霉GM抗原成分，而且还能够识别其他曲霉菌属抗原成分，这一特性提示，本研究中制备的抗烟曲霉GM单克隆抗体，在临床曲霉菌感染诊断中有其更广泛的应用价值，在临床诊疗中，当临床怀疑曲霉菌感染时，通常临床诊断并不追求菌种的鉴定，只要能够鉴定到曲霉属就足以满足临床需要，因为无论是烟曲霉还是其他曲霉菌导致的侵袭性曲霉菌感染的临床表现及治疗方法基本相同。建立双抗体夹心ELISA法检测烟曲霉GM抗原，选择两株高亲和力并针对不同抗原决定簇的McAb7E11A1、9D47A1，分别为包被抗体和酶标抗体，以纯化AFMP1(GM重组蛋白)作为标准检测品，以相对应牛血清白蛋白(BSA)为阴性对照，建立双抗体夹心ELISA法，以平均450nm吸光值(OD)为纵坐标，以AFMP1蛋白的浓度为横座标，绘制标准曲线，以AFMP1标准品最大稀释浓度的OD值是阴性对照的2倍为最少可测值，结果显示检测最高灵敏度为0.1ng／ml，可测AFMP1标准品浓度范围0.1～60 ng／ml之间在标准曲线上形成直线，表明可测范围为0.1～60ng／ml。第二部分建立侵袭性烟曲霉感染动物模型及其抗原检测将新西兰大白兔12只分为两组，组1：实验组6只；组2：对照组设正常对照4只和免疫抑制对照4只。实验组和免疫抑制对照组两组动物同时给予静脉滴注氧化可的松15mg／kg、环磷酰胺25mg／kg连续二天；第三天肌肉注射氢化可的松15mg／kg，实验组给予耳缘静脉注射5×10~6CFU／ml的烟曲霉孢子混悬液1ml，免疫抑制对照组耳缘静脉注射生理盐水1ml。分别采集各组大白兔感染前、感染后24、48、72、96小时血液；感染后96小时处死两组兔，无菌下切取肺、肝、脾、肾等脏器，取部分组织制成组织匀浆，其余组织置于10％甲醛溶液中固定8小时以上，制备组织腊块备用。脏器组织培养：将肺、肝、脾、肾组织分别制成组织匀浆，接种于沙堡—氯霉素琼脂培养基上，25℃培养96小时以上，观察烟曲霉菌菌落生长情况、显微镜下观察烟曲霉菌丝、孢子及分生孢子形态。脏器组织HE染色：肺、肝、脾、肾组织腊块HE染色，检测曲霉菌。免疫酶组织化学染色：用辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗烟曲霉单克隆抗体，对肺、肝、脾、肾组织作免疫酶组织化学染色。双抗体夹心ELISA法检测血清：用抗烟曲霉GM单克隆抗体7E11A1、9D47A1，分别作为包被抗体和酶标抗体，以双抗体夹心ELISA检测血清中烟曲霉抗原。结果：脏器组织培养：实验组：肺、肝、脾、肾组织匀浆，接种于沙堡—氯霉素琼脂培养基上，25℃培养7天，可见特征性烟绿色菌落生长，小培养玻片棉兰染色，显微镜下观察烟曲霉菌孢子、分生孢子和菌丝，菌丝呈条状有分隔，菌丝分支呈锐角。对照组：组织培养未见真菌生长。脏器组织HE染色：实验组：肺、肝、脾、肾等组织HE染色分别见有散在和／或聚集的曲霉菌孢子和菌丝，菌丝呈条状有分隔，锐角分支。对照组：脏器组织HE染色未见曲霉菌孢子和菌丝。脏器组织培养和HE染色结果证明侵袭性曲霉菌感染实验动物模型建立成功。免疫酶组织化学染色：实验组：肺、肝、脾、肾等组织行免疫酶组织化学染色，可见散在和成堆被染成黄褐色的清晰可见的曲霉菌孢子和菌丝，菌丝呈条状有分隔，锐角分支。对照组：未见黄褐色曲霉菌孢子和菌丝。双抗体夹心ELISA法检测：注射烟曲霉孢子混悬液后24小时即可在血标本中检测到烟曲霉GM抗原，24小时早期检测阳性率83％(5／6)；接种后第48—96小时的血清标本检测均为阳性。正常对照组及免疫抑制对照组血清烟曲霉GM抗原检测均为阴性。染菌后24、48、72、96小时OD值呈逐渐升高趋势。免疫酶组织化学染色及双抗体夹心ELISA法检测结果显示，抗烟曲霉单克隆抗体可特异地识别组织及血清中烟曲霉抗原。第三部分抗烟曲霉GM抗体在曲霉菌感染抗原检测的临床应用。临床病例资料：临床曲霉菌感染高危患者15例次，男8例，女7例，年龄3月龄—80岁，其中病理确诊为曲霉菌感染2例，高度怀疑曲霉菌感染3例，可疑曲霉菌感染病例10例。收集上述高危患者血清标本，低温冻存备用。收集上述高危患者临床资料，包括病人的基本情况、诊断、病情演变、各种检查结果特别是微生物学检查结果及病理和影像检测结果、治疗转归等。双抗体夹心ELISA法检测临床高危患者血清标本，以抗烟曲霉GM单克降抗体7E11A1、9D47A1，分别作为包被抗体和酶标抗体，作双抗体夹心ELISA检测血清中烟曲霉GM抗原。结果：以我们制备的抗烟曲霉GM单克隆抗体，作双抗体夹心ELISA法检测曲霉菌GM抗原，共检测临床高危患者血清标本15例，5例阳性，病理确诊和临床高度怀疑曲霉菌感染病例的血清ELISA检测均为阳性；1例临床高度怀疑曲霉菌感染患者，采集急性期和恢复期2份血标本动态观察，结果在疾病高峰期血清ELISA检测强阳性，恢复期血清ELISA检测阴性，随着治疗后病情的好转，血清检测转阴。临床3例痰培养曲霉菌阳性的可疑病例，经双抗体夹心ELISA法检测GM抗原为阴性。上述研究表明，我们从烟曲霉培养物中提取烟曲霉GM抗原成分，免疫小鼠，制备抗烟曲霉GM单克隆抗体，经筛选得到特异性好、亲和力高、针对不同抗原决定族的杂交瘤细胞株，组成配对McAb，建立一种快速、灵敏度高、特异性强的双抗体夹心ELISA方法检测曲霉菌GM抗原。建立侵袭性烟曲霉感染实验动物模型，双抗体夹心ELISA法检测结果显示，在动物感染后24h检测到血清阳性结果，之后随着感染的加重阳性滴度增加；免疫酶组织化学染色及双抗体夹心ELISA法检测结果显示，抗烟曲霉单克隆抗体可特异地识别组织及血清中烟曲霉抗原。临床高危患者血清检测显示，应用抗烟曲霉GM单克隆抗体，作双抗体夹心ELISA检测高危病人血清GM抗原，检测阳性结果与经组织病理确诊和临床高度怀疑曲霉菌感染的诊断相一致，初步证明以抗烟曲霉GM单克隆抗体，作双抗体夹心ELISA检测血清曲霉菌GM抗原的方法，有用于临床的潜在价值，可作为临床曲霉菌感染的早期快速诊断方法之一，其动态监测有可能作为评价IA病情严重程度和抗真菌药物疗效的指标之一。抗烟曲霉GM单克隆抗体用于烟曲霉感染免疫酶组织化学染色，具有快速、直观、清晰可见、结果容易判断的优点，为烟曲霉菌组织学检测增加了一种特异性的诊断手段。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 抗烟曲霉单克隆抗体的制备及鉴定
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 第二部分 侵袭性烟曲霉菌感染动物模型建立及抗原检测
• 1 引言
• 2 材料和方法
• 3 制备烟曲霉孢子悬液
• 4 侵袭性烟曲霉感染动物模型建立
• 5 结果
• 6 讨论
• 第三部分 抗烟曲霉单克隆抗体在曲霉感染抗原检测的临床应用
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 参考文献
• 附录
• 1 缩略词表
• 2 主要仪器设备
• 3 主要溶液配制
• 4 综述
• 参考文献
• 在读期间发表的文章
• 致谢