人骨膜中骨质疏松症相关基因的筛选和鉴定

论文摘要

原发性骨质疏松症被认为是多基因的全身性骨骼疾病，结局以骨强度下降，骨折风险增加为特征，好发于绝经后妇女和老年人群，已成为严重的公共卫生问题。寻找骨质疏松症相关基因的研究在过去20年中已广泛进行，这些研究主要着重于3个方面：寻找正常和病变组织中基因表达的差异、研究内源性调节因子（如激素、受体）的作用、鉴别在药物治疗过程中的基因表达的改变。通过传统的基因表达研究（如Northern杂交，Southern杂交，Western杂交，RT-PCR等）提示了关于骨质疏松症发生和发展的可能机制，确认众多基因参与了该病的复杂调控。然而，传统方法的局限性阻碍了该领域的进一步发展。主要缺点是传统的基因研究仅能同时涉及少数基因，而实际上，很多组织和细胞表达的基因同时对个体间骨量的差异有影响，可能对骨质疏松症的发展或预防也产生影响。目前已鉴定的与骨质疏松症相关的基因还不能够完全说明该病的病理生理机制，因此，还有一些影响骨质疏松症发生和发展的基因有待发现。考虑到目前有效防治骨质疏松症的药物种类还有限，寻找相关的功能基因也为开发治疗该病的药物作用的基因靶点留下巨大的想像空间。长久以来，对骨质疏松症相关基因的体内外实验研究重视了骨髓基质干细胞的发育、分化和调节等，认为骨髓是成骨细胞和破骨细胞前体的发源地，而对骨膜维持骨强度、在成骨过程中所起的重要作用有所忽视。事实上，成年个体的骨膜下成骨在维持骨强度时发挥重要作用。本文拟研究人骨膜中表达基因的特点，筛选参与骨形成从而可能与骨质疏松症有关的基因，并对其中一个基因在影响骨形成方面的功能上进行初步验证。材料和方法1．人骨膜全长cDNA文库的构建和鉴定运用末端模板转换技术（SMART）构建人骨膜全长cDNA文库，滴定库容量并应用菌落PCR的方法随机抽取80个克隆确定平均插入片段长度，随后进行大规模测序。2．人骨膜基因表达的功能分类和特点对骨膜cDNA文库的大规模测序结果进行生物信息的比对分析，与Genebank、Expasy、Ensemble等公共数据库进行比对，得到了序列的染色体定位、进行了GO功能分类、探查了未知功能的基因，并对已知或预测基因进行了注释：与已知的骨基因库的数据进行对比，确认骨膜表达基因的特点。3．根据全长基因的序列特点选择一个基因，LOC221143，将其蛋白质编码区（CDS）克隆到增强型的绿色荧光蛋白（EGFP）的报告质粒中，然后将重组质粒转染类成骨细胞系U2OS，以确定该蛋白质的亚细胞定位并观察该基因的超表达对U2OS细胞增殖功能的影响。也利用RT-PCR的方法探索了该基因的组织分布。同时，我们还运用生物信息学分析了该基因的结构特征，并预测了其表达蛋白的特征和功能，以对实验的结果进行验证。结果1．构建的人骨膜全长cDNA文库的库容量为5.2×106，平均插入片段的长度为1.2kb（0.7kb～4.0kb）。随机测序拼接得到5230个聚类群（contigs）和4714个独立EST（singlets）。2．去除长度＜100bp和冗余序列，比对了剩余的5659条序列（2796条contigs，2863条singlets），其中5453条序列（96.4％）得到了染色体定位，对838个能够进行GO分类的已知基因的EST进行了详细的注释，发现其中30.67％为酶，6.80％在信号转导中起作用。在与骨相关基因库的比较中，我们发现了一些骨相关基因也存在骨膜中，也探测出一些已知序列功能未知的基因。3．LOC221143是一个全长基因，定位在人的13号染色体的长臂上，含有5个外显子，表达的蛋白质分子量为24.564kDa，等电点为4.191。同源性序列比较发现，该基因的同源序列在各种模式生物中都存在，且在进化过程中较为保守，结构分析提示该蛋白可能是一种细胞质中的酶，有类似DNA甲基化酶的功能。在人的组织如心脏、小肠、骨骼肌、骨膜均有较丰富的表达，在U2OS细胞系中也有表达。EGFP的报告系统也显示LOC221143表达的蛋白定位于胞浆中，与生物信息预测的结果一致。另外，该基因的超表达未发现对U2OS细胞的增殖曲线有明显影响。结论1．人骨膜全长cDNA文库的成功构建是寻找骨膜组织特异性的基因从而研究骨相关疾病的发病机制、发现具有药物开发靶点的功能基因的基础工作。2．骨膜表达基因的分类提供了人骨膜表达基因的特点，同时探查到的未知功能的基因也为后续的研究提供了材料和方向。3．LOC221143基因高度保守，其表达产物可能是一种细胞内的DNA甲基化酶，组织表达广泛，提示其在维持细胞基本功能和生命的基本过程中起作用。

论文目录

• 主要缩略词表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 人骨膜全长cDNA文库的构建和鉴定
• 材料与方法
• 主要仪器设备
• 主要试剂
• 材料来源
• 方法
• 一、总RNA的提取和鉴定
• 二、cDNA的合成及文库构建
• 三、库容量的滴定
• 四、测定文库中平均插入片断长度
• 五、大规模的DNA测序
• 六、测序得到的结果进行初步处理
• 结果
• 1.总RNA及cDNA链合成的鉴定结果
• 2.库容量
• 3.平均插入片段大小
• 4.大规模测序时琼脂糖电泳显示的质粒图谱
• 5. 测序结果
• 讨论
• 参考文献一
• 第二部分 人骨膜表达的基因功能分类和特点
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献二
• 第三部分 LOC221143基因的特征及亚细胞定位
• 一、材料
• 二、方法
• （一） 引物的设计与合成
• （二） pEGFP重组载体的构建及转染
• （三） Wersternblot检验U2OS表达GFP及融合蛋白的状况
• （四） 生长曲线绘制
• （五） RT-PCR进行鉴定LOC221143基因的组织分布
• （六） 生物信息分析方法
• 三、结果
• （一） 重组质粒构建和转染结果
• （二） RT—PCR组织分布结果
• （三） 生物信息学分析结果
• 四、讨论
• 参考文献三
• 综述 骨质疏松症相关基因的遗传学研究进展
• 一、骨质疏松症的遗传率和研究表型的选择
• 二、鉴定复杂性状基因的分子遗传学方法
• （一） 家系连锁分析
• （二） 等位基因共享研究
• （三） 关联分析
• （四） 传递不平衡检验及其派生法
• 三、几种受体基因的多态性
• （一） 维生素D受体基因的多态性
• （二） 雌激素受体基因的多态性
• （三）I型胶原基因的多态性
• 四、全基因组扫描染色体连锁定位问题
• 五、总结和展望
• 综述参考文献
• 研究生期间撰写论文及参加会议情况
• 研究生期间参加研究课题情况
• 致谢
• 经费来源