高浓度rhBMP-2m复性条件的探讨

论文摘要

目的:骨形成蛋白2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）是骨形成蛋白（bone morphogenetic protein, BMP）家族的一员。目前,已经发现15种以上不同的人BMP。其中以人BMP-2诱骨活性最强,并与其他BMP有协同作用。BMP2的活性形式是二聚体,在BMP成熟肽单链中有七个半胱氨酸残基,形成三个肽链内二硫键,两条肽链间再通过一个二硫键连接后才具有活性。大肠杆菌是最常用的基因工程表达系统。虽然它不能象真核系统一样进行翻译后加工,但由于其遗传背景清楚、使用安全、操作简单、产量高、生产周期短和成本低的优点,现在仍是使用最广泛,不可替代的表达系统。用真核表达的rhBMP-2m虽然活性很好,但是其生产成本太高,产品昂贵,难于大规模生产,限制了其临床的应用。我们采用大肠杆菌系统非融合表达目的蛋白rhBMP-2m,其表达产量高,但是由于大肠杆菌本身的特性使其表达产物以无活性的包含体形式存在。这就需要进一步的复性才能得到有活性的目的蛋白。由于成熟的活性二聚体BMP是有7个二硫键、疏水性强的分子,其复性难度大,至今还没有理想的方法。本文就是在高密度发酵,纯化rhBMP-2m的基础上进行rhBMP-2m的复性方法的探讨,找出适合rhBMP-2m复性的方法,然后进行细胞的测活,检验复性效果。方法:1. rhBMP-2m的高密度发酵:用15LNBS发酵罐,采用恒溶氧-补料分批培养的方法进行DH5α/pDH2-BMP-2m的高密度发酵。在发酵过程中始终保持溶氧40%,pH7.0。32℃生长6h后,恒速添加补料。16h后将温度在最短时间内升高到42℃诱导表达4h,结束发酵。2. rhBMP-2m的纯化:高密度发酵后的菌液,用STE、溶菌酶、脱氧胆酸钠和超声裂菌后,用TrionX-100进行4次包含体的超声处理和洗涤。经洗涤的包含体进行SP-Sepharose FF阳离子柱层析和Q-Sepharose FF阴离子柱层析两次纯化。3. rhBMP-2m的复性:按朱帮福建立的BMP活性检测方法（国家专利ZL 01 1 31813.9）,经纯化后的目的蛋白rhBMP-2m在不同的温度、复性液pH、氧化交换系统浓度、盐浓度等条件下进行透析复性。透析复性后进行非还原的SDS-PAGE,检测rhBMP-2m活性形式二聚体的含量,同时找出相对较优的复性方法并对其复性产物进行0.22μm微孔滤膜除菌并计算其损失率。4.复性后rhBMP-2m活性鉴定:将复苏后的C2C12细胞培养48h后按1×105个细胞接种于24孔板上,将每个样品分3个浓度梯度（0.2 mg/mL,0.02 mg/mL,0.002 mg/mL）加入。另每个样品设立2个对照孔。1个为空白对照,只加入培养液;1个为复性前样品（浓度为1mg/ml）。在二氧化碳温箱中37℃培养24h后检测其荧光值,对比复性前后rhBMP-2m的活性变化。结果与讨论:1. rhBMP-2m的高密度发酵:经高密度发酵后,发酵液的OD600值为60.5,4L发酵液离心收集的菌体湿重为386g。SDS-PAGE后经灰度扫描,目的蛋白占菌体总蛋白的20%。发酵过程中菌种接种浓度、接种时的无菌环境、培养基的成分、补料的成分、流加的方式及流加速度、pH、溶氧和温度等因素对高密度发酵的结果均有影响,在发酵过程中要控制发酵的每个环节并优化每个影响因素才能得到理想的结果。而且试管摇菌诱导表达时目的蛋白占总蛋白质的比例一般都高于高密度发酵的诱导表达,表明我们的高密度发酵和表达的条件还没有很好地优化。2. rhBMP-2m的纯化:高密度发酵后目的蛋白纯度为20%,经四次包含体洗涤后的纯度达到75%,回收率为51.19%。洗涤后的包含体经阳离子柱层析纯化后纯度达到85%,总回收率为32.23%。再次经阴离子柱层析后纯度达到95%,总回收率为19.70%。从洗涤和纯化数据中我们可以看出,包含体洗涤和纯化的次数越多,蛋白纯度越高但其损失也越大。所以纯化时要综合考虑蛋白的性质、所需蛋白的纯度、蛋白回收率和纯化的成本以选择适合的纯化方法。3. rhBMP-2m的复性:本实验探讨了不同因素对rhBMP-2m复性的影响,包括pH、温度、蛋白的浓度等。我们发现复性的pH、温度对蛋白复性的结果影响很大,但盐浓度、氧化交换系统的浓度和透析外液体积对蛋白复性影响不是很大。pH8.5时复性效率较高,二聚体的含量达到了30%;而pH4.8时rhBMP-2m完全可溶。低温4℃有利于复性蛋白的正确折叠,其二聚体含量达到30%。在高的蛋白浓度10mg/ml时复性效率可以和0.1mg/ml蛋白浓度的复性效率相当,而高浓度有利于复性后蛋白的浓缩回收,减少复性rhBMP的损失,降低工作强度,节省工作时间,从而有利于工业放大。在透析除尿素的过程中我们进一步发现,透析复性时rhBMP-2m的浓度最大只能达到6mg/ml,超过这一浓度即使改变pH,在除去变性剂尿素时目的蛋白都会沉淀析出。考虑到复性时rhBMP-2m的可溶性及后续的浓缩回收,我们采用6mg/ml高蛋白浓度的改变pH的方法进行透析复性,实现了高pH（pH8.5）条件下复性后,在低pH（pH4.8）条件下用一步透析和分步透析除变性剂尿素。用合适的蛋白浓度及改变pH的透析复性较好的解决了rhBMP-2m的可溶性问题,使得过滤除菌成为可能。实验结果也证实经该方法复性后微孔滤膜除菌蛋白损失很小不超过10%。经一步透析和分步透析除尿素的方法对复性后rhBMP-2m的活性形式二聚体的含量没有影响。这复性方案解决了以往稀释法等低蛋白浓度复性后浓缩时rhBMP严重损失和应用时难以除菌的难题。4.复性后rhBMP-2m的活性鉴定:同时细胞测活显示两组活性均较复性前的蛋白有明显的升高复性前rhBMP-2m荧光值为5左右,复性后20μg /mL的rhBMP-2m经一步透析除尿素和分步透析除尿素的荧光值达到最大均为20左右。经T检验（p<0.001）可以看出复性前后rhBMP-2m的活性有显著差别,但是一步与分步除尿素两者之间的细胞活性并没有明显的差别（p>0.005）。虽然理论上推测一步透析除尿素使得rhBMP-2m的环境改变剧烈会引起二硫键的错配,但是其非还原性SDS-PAGE的结果和细胞测活的结果均显示一步透析除尿素的复性效果丝毫不亚于分步透析除尿素。提示我们影响复性的因素有很多,不同的蛋白所要求的复性条件很也不相同,这也是蛋白复性的难点之一。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 文献回顾
• 正文 高浓度的RHBMP-2M复性条件的探讨
• 0 引言
• 1. 材料
• 2. 方法
• 2.1 DH5α/pDH2-rhBMP2m的高密度发酵
• 2.2 裂菌、包涵体洗涤
• 2.3 包含体的纯化
• 2.4 蛋白复性
• 2.5 蛋白定量
• 2.6 蛋白除菌
• 2.7 复性后的rhBMP-2m细胞生物活性测定
• 3. 实验结果
• 3.1 DH5α/pDH2-BMP2m 高密度发酵后蛋白表达情况
• 3.2 裂菌、包涵体洗涤结果
• 3.3 rhBMP-2m纯化结果
• 3.4 rhBMP-2m的复性结果
• 3.5 rhBMP-2m除菌结果
• 3.6 细胞活性的测定
• 4. 讨论
• 4.1 rhBMP-2m的高密度发酵
• 4.2 rhBMP-2m包含体的洗涤和纯化
• 4.3 rhBMP-2m的复性
• 4.4 rhBMP-2m的复性后的测活
• 小结
• 参考文献
• 个人简历及研究成果
• 致谢