论文摘要
资源的搜集和发现的策略是微生物天然产物发现的两个重要方面。红树林是位于海洋与陆地之间的特殊生态系统,近年来从该环境中分离到了很多放线菌新种和新型化合物,这使得红树林微生物资源的研究越来越受到人们的重视。本研究以实验室前期从红树林分离到的经检测有各种生物活性的77株链霉菌为研究对象,首先根据实验菌株和模式菌株的16S rRNA基因序列构建系统发育树,以确定77株链霉菌的系统分类地位。用3对简并引物对77株菌的次级代谢基因即PKS和NRPS基因进行检测,将其中40株菌PCR扩增得到的PKS和NRPS基因片段转化克隆后测序,将特异的克隆子序列进行BLASTx比对,对菌株的次级代谢基因多样性进行分析。将克隆子序列与从GenBank中选取的同源序列一起进行聚类分析,根据菌株的16S rRNA基因序列和分离地点分析PKS和NRPS基因与菌株分类地位和分离地点的相关性。将77株菌用FM3培养基发酵,产物用HPLC检测,分析菌株发酵产物之间的差异。对菌株061316和172205进行全基因组测序,之后用anti-SMASH软件对菌株基因组中的次级代谢产物生物合成基因簇进行预测。根据10株已获得全基因组序列放线菌的次级代谢基因预测结果,对简并引物扩增得到的克隆子序列进行评价。对之前未分离到化合物的菌株172205进行8种培养基的发酵,以期找出适合其产生次代谢产物的培养基,并对2种antiSMASH预测的化合物根据预测化合物的发酵条件进行发酵和产物检测。77株链霉菌可分为15个分支（Clade）,77株菌的PKSⅠ、PKS Ⅱ和NRPS基因阳性率分别为64.94%、59.74%和79.22%,其中有5株菌三种基因均未检测到。从77株菌中选出40株有较好生物活性或没有生物活性但含有PKS或NRPS基因的菌株,从其中27株PKS Ⅰ基因阳性菌株中共获得62条特异的克隆子序列,其中超过一半的序列与GenBank中同源序列的相似度小于85%,这表明红树林链霉菌不但能合成不同类型的聚酮类化合物而且其中一些极有可能是新型化合物。从27株PKS Ⅱ基因阳性菌株中共获得40条特异的KSa域序列,从BLASTx比对的结果来看,一般菌株只拥有1-2个PKS Ⅱ基因。NRPS的多样性最高,从34株阳性菌株中共获得118条特异的Adenylation域序列,从比对的结果中,可以预测26条序列涉及的生物合成途径。PKS Ⅰ基因的KS和AT域序列是分别根据KS域的功能和底物的特异性进行聚类的,与菌株的分类地位无关；菌株PKS Ⅱ基因KSa域序列的聚类分析表明该基因分为两大类,分别参与孢子色素和抗生素的合成,参与抗生素合成的KSa域序列是按照化合物类型进行聚类,而色素合成相关的PKS Ⅱ基因与菌株的分类地位相关；NRPS基因与菌株的分类地位也无相关性。不同分离地点的菌株也有可能拥有相似的次级代谢基因。发酵产物的HPLC检测结果表明,在相同的发酵条件下,不同Clade的菌株产生的次级代谢产物数目差别较大,16S rRNA序列相似性大于99%的菌株能产生类似的化合物。菌株061316基因组大小为7.3 Mb（GC含量为71.42%）,经过antiSMASH预测,其中包含12类共25个次级代谢产物生物合成途径；Streptomyces qinglanensis 172205基因组大小为6.2 Mb （GC含量为72.68%）,预测其中包含9类共21个生物合成基因簇,由此可以看出,这两株菌有很大的挖掘潜力。根据10株放线菌的基因组预测结果发现,用简并引物扩增获得了约31%的PKS Ⅰ基因,约92%的PKSⅡ基因和约51%的NRPS基因,表明本研究所用的简并引物可以有效用于PKSⅡ基因的检测,但对PKSⅠ和NRPS基因检测的覆盖率有待提高。适合Streptomyces qinglanensis 172205产生次级代谢产物的培养基为FM9、FM17和FM19,对E1和AlBFe+C培养基的发酵产物进行LC-MS检测,但没有发现预测的化合物Kijanimicin和Tetronomycin。本研究表明红树林链霉菌中含有丰富的次级代谢基因,PCR检测、克隆子测序及其多样性分析以及基因组测序预测结果可以为新天然产物的发现提供信息。