仔猪水肿病大肠杆菌SLT-Ⅱe基因突变菌株的构建

论文摘要

仔猪水肿病是由产Vero细胞毒素大肠杆菌（VTEC）引起的致死性传染病，能引起断奶仔猪四肢麻痹、步态蹒跚、痉挛和昏迷等神经症状，死亡率很高。剖检可见胃壁和肠系膜水肿，因此称之为“水肿病”。随着近几十年的深入研究，人们对水肿病的致病机理有了比较详细的了解，明确了仔猪水肿病的发生与产Vero细胞毒素大肠杆菌的两个致病因子——F18ab（F107）菌毛与志贺样毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）密切相关。其中SLT-Ⅱe起主要的毒力作用。本实验应用定点突变技术将SLT-Ⅱe基因第167位谷氨酸和第170位精氨酸分别突变为谷氨酰胺和亮氨酸，再通过同源重组技术，利用自杀质粒pCVD442将突变后的SLT-Ⅱe*基因重组到野生的大肠杆菌O139中，替换原有的SLT-Ⅱe基因，构建出一株基因突变菌株。用4-6周龄清洁级昆明鼠和Vero细胞对突变菌株进行毒力检测，实验结果表明，突变菌株对小鼠肠胃等组织的损伤明显轻于野生株，而对Vero细胞的毒力可降至野生株的1／500。通过基因突变构建弱毒或无毒菌株，将对仔猪水肿病口服疫苗的研制提供技术保障和物质基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 引言
• 1.1 仔猪水肿病的概述
• 1.1.1 流行特点
• 1.1.2 发病原因
• 1.1.3 临床症状
• 1.1.4 病理变化
• 1.2 病原学
• 1.2.1 主要致病因子
• 1.2.2 致病机理
• 1.3 仔猪水肿病的诊断与预防
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 质粒和菌株
• 2.1.2 实验动物及细胞系
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 PCR扩增引物
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 SLT-Ⅱe基因及L-SLT-Ⅱe基因的扩增
• 2.2.2 SLT-Ⅱe基因及L-SLT-Ⅱe基因克隆载体的构建
• *）的扩增'>2.2.3 SLT-Ⅱe突变基因（SLT-Ⅱe^*）的扩增
• *）重组自杀质粒的构建'>2.2.4 SLT-Ⅱe突变基因（SLT-Ⅱe^*）重组自杀质粒的构建
• 139与重组自杀质粒的同源重组'>2.2.5 野生菌株O₁₃₉与重组自杀质粒的同源重组
• 139（SLT-Ⅱe^*）（Nal^R）的毒力检测'>2.2.6 突变菌株O₁₃₉（SLT-Ⅱe^*）（Nal^R）的毒力检测
• 3 结果
• 3.1 SLT-Ⅱe基因及L-SLT-Ⅱ基因的PCR扩增
• 3.2 SLT-Ⅱe基因及L-SLT-Ⅱe基因克隆载体的构建
• 3.2.1 pMD-SLT-Ⅱe的鉴定
• 3.2.2 pMD-L-SLT-Ⅱe的鉴定
• *）重组自杀质粒的构建'>3.3 SLT-Ⅱe突变基因（SLT-Ⅱe^*）重组自杀质粒的构建
• *-SLT-Ⅱe基因及R^*-SLT-Ⅱe基因的PCR扩增'>3.3.1 L^*-SLT-Ⅱe基因及R^*-SLT-Ⅱe基因的PCR扩增
• *-SLT-Ⅱe的鉴定'>3.3.2 pMD-L^*-SLT-Ⅱe的鉴定
• *-SLT-Ⅱe的鉴定'>3.3.3 pMD-R^*-SLT-Ⅱe的鉴定
• *）的PCR扩增'>3.3.4 SLT-Ⅱe突变基因（SLT-Ⅱe^*）的PCR扩增
• *克隆载体的鉴定'>3.3.5 pMD-SLT-Ⅱe^*克隆载体的鉴定
• *基因重组自杀质粒pCVD442::SLT-Ⅱe^*的鉴定'>3.3.6 SLT-Ⅱe^*基因重组自杀质粒pCVD442::SLT-Ⅱe^*的鉴定
• 139（SLT-Ⅱe^*）（Nal^R）筛选及鉴定结果'>3.4 突变菌株O₁₃₉（SLT-Ⅱe^*）（Nal^R）筛选及鉴定结果
• 3.5 细菌过滤上清蛋白含量测定结果
• 3.6 Vero细胞毒性检测
• 3.7 突变菌株对小鼠的毒性检测
• 4 讨论
• 4.1 实验中的问题分析
• 4.1.1 pCVD442自杀质粒的生物学功能
• 4.1.2 野生菌与突变菌的菌液上清蛋白含量计算
• 4.1.3 突变菌株对Vero细胞的毒性
• 4.1.4 突变菌株对小鼠毒性
• 4.2 突变菌株作为仔猪水肿病口服疫苗菌种的前景
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文