改良的气体环境对体外骨髓间充质干细胞培养影响的实验研究

论文摘要

在组织工程瓣膜（tissue engineering heart valve,TEHV）的研究过程中,如何短时间获取大量功能状态良好的骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）,维持MSCs的原始状态,及控制MSCs分化方向是当前研究的热点。影响MSCs生长、功能状态及分化的因素很多,包括O2浓度、PH值、温度、生长因子、血清、培养基、剪切力、细胞密度等。微环境中O2浓度及PH值是非常重要因素:O2对MSCs的影响是多个方面的,适当的O2浓度可以促进MSCs的增殖、分化、原始状态的维持; MSCs对培养环境的PH值的变化非常敏感,不同PH值对MSCs的增殖、分化及生物学功能有着显著影响。目前传统的细胞体外培养环境中O2浓度约为21%,CO2浓度约为5%,所用培养基PH值为7.27.4。而人体正常组织和组织间隙中的O2浓度3%9%,骨髓腔内O2浓度1%7%;动脉血CO2浓度约5% ,静脉血CO2浓度约6% ,骨髓腔内CO2浓度约7%;人体动静脉血液及骨髓腔内pH值恒定在7.20～7.50间。目前,低氧环境能显著影响干细胞的增殖和生长因子的分泌,但未见低氧对种子细胞黏附功能影响的研究报道。为此,我们分别采用6% O2的培养环境培养MSCs,探讨低氧环境对MSCs增殖功能及粘附功能影响。同时针对传统的细胞培养液如DMEM, DF-12, M199等均随着使用或存放时间的延长,培养液的pH值会明显升高,我们首次尝试7%CO2环境来增强培养液中CO2/HCO3-缓冲能力,稳定培养液pH值,探讨此种稳定的培养环境对MSCs增殖及细胞原始状态的影响,旨在探索合适的细胞培养的条件。第一部分:小鼠MSCs细胞分离、纯化、扩增并鉴定:经Percoll密度梯度离心和贴壁生长的方法从采集的小鼠骨髓液中提取,倒置显微镜观察其形态,通过免疫组化及流式细胞仪来进行鉴定。结果:选取的6个培养瓶的小鼠MSCs,进行免疫组化染色显示:ɑ-SMA, Vimentin均呈阳性表达;小鼠MSCs流式细胞仪鉴定示:CD29, CD44, CD90及CD105呈现高度阳性表达,阳性率分别为92.7%,99.6%,99.5%及99.4%,而CD34和CD45阳性表达率仅分别为4.6%和3.2%。结果表明经此种方法分离纯化而来的细胞为骨髓间充质干细胞。第二部分:6% O2与21% O2条件下小鼠MSCs增殖、粘附及细胞外基质表达量的比较:两组间各挑选生长良好的3代对数生长期细胞,一共分为6个对照组,分别进行增殖实验,粘附实验,及通过Western- blotting测定FN及VN的表达,初步评价两种不同O2环境下MSCs的增殖、分泌及粘附功能状态。结果:6% O2条件下培养的小鼠MSCs较21%O2有更强的增殖能力（p<0.05）、粘附能力（p<0.05）及分泌功能（p<0.05）;第三部分:7% CO2与5% O2条件下小鼠MSCs增殖能力及OCT-4蛋白表达量的比较:两组间各挑选生长良好的3代对数生长期细胞,一共分为6个对照组,分别进行增殖实验,及通过Western-blotting测定OCT-4蛋白的表达,初步评价两种不同CO2环境下MSCs的增殖及干细胞原始状态的维持。结果:7% CO2条件下培养的小鼠MSCs较5% CO2有更强的增殖能力（P<0.05）;同时OCT-4蛋白的表达含量也较高,表明7% CO2条件更有利于小鼠MSCs原始状态的维持（P<0.05）;第四部分:7%CO2 +6% O2与5%CO2 +6% O2条件下小鼠MSCs增殖、粘附及原始状态维持的比较:两组间各挑选生长良好的3代对数生长期细胞,一共分为6个对照组,分别进行增殖实验,粘附实验,及通过Western- blotting测定FN及OCT-4的表达,初步评价两种不同气体环境下MSCs的增殖、粘附功能及原始状态维持。结果:7%CO2 +6% O2条件下培养的小鼠MSCs较5%CO2 +6% O2有更强的增殖能力（P<0.05）及粘附能力（P<0.05）,同时OCT-4的表达更高（p<0.05）;结论:O2和PH值是细胞生长的重要的微环境,对MSCs的增殖、分化有着重要影响。通过模拟生物体内微环境来进行MSCs的体外培养,有利于快速获取理想的质和量的种子细胞,对组织工程的研究有着积极的意义。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 文献回顾
• 正文
• 第一部分 种子细胞体外分离、培养、扩增和鉴定
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 2与21% O₂对小鼠MSCs增殖、粘附及细胞外基质表达影响的比较'>第二部分 6% O₂与21% O₂对小鼠MSCs增殖、粘附及细胞外基质表达影响的比较
• 1 材料和试剂
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 2 与5% CO₂对小鼠MSCs增殖及原始状态维持的影响的较'>第三部分 7% CO₂ 与5% CO₂对小鼠MSCs增殖及原始状态维持的影响的较
• 1 试剂和仪器
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 2 +6% O₂与 7%CO₂ +21% O₂条件下小鼠MSCs增殖、粘附及原始状态维持的比较'>第四部分 7%CO₂ +6% O₂与 7%CO₂ +21% O₂条件下小鼠MSCs增殖、粘附及原始状态维持的比较
• 1 试剂和仪器
• 2 方法
• 3 结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 个人简历
• 硕士期间发表文章
• 致谢