论文摘要
目的:构建重组小鼠锌α2糖蛋白（Zinc-α2-glycoprotein ）真核表达载体,并稳定转染3T3-L1细胞,观察3T3-L1细胞过表达ZAG后对线粒体生物合成相关因子的影响。方法:提取正常小鼠肝脏组织总RNA,通过RT-RCR方法扩增出ZAG序列,克隆入经XbaⅠ和HindШ双酶切后的pcDNA3.1（-）,重组小鼠ZAG真核表达质粒（pcDNA3.1（-）-mZAG）经转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆,酶切和核苷酸测序鉴定后经脂质体转染3T3-L1细胞,G418筛选阳性克隆扩增,RT-PCR法鉴定ZAG阳性细胞株并检测过氧化物酶增殖型受体γ辅助活化因子1α（PGC-1α）、核呼吸因子1/2（NRF-1/2）、线粒体转录因子A（mtTFA）mRNA表达,Western Blot检测PGC-1α、NRF1/2、mtTFA蛋白的表达。结果:成功克隆小鼠ZAG cDNA全序列,并将其与pcDNA3.1（-）载体片段连接,构建成pcDNA3.1（-）-mZAG表达质粒。重组真核表达质粒经限制性核酸内切酶XbaⅠ和HindШ酶切后获得5.4kb和924bp两个片段,大小与理论值一致,并由核苷酸序列测定证实。pcDNA3.1（-）-mZAG成功转染3T3-L1细胞,在转染的3T3-L1细胞中ZAG基因的转录明显上调,过表达ZAG后,PGC-1α、NRF-1/2、mtTFA表达均上调。结论:成功构建ZAG基因的真核表达质粒pcDNA3.1（-）-mZAG,构建ZAG稳定过表达细胞系,在稳定转染的3T3-L1细胞中,ZAGmRNA表达水平与线粒体生物合成有关,ZAG对线粒体生物合成相关因子PGC-1α、NRF-1/2、mtTFA的表达有促进作用。目的:探讨锌α2糖蛋白（Zinc-α2-glycoprotein, ZAG）促进3T3-L1细胞线粒体生物合成相关因子的PKA和p38MAPK信号通路机制。方法:体外培养3T3-L1细胞,分别加入ZAG、PKA抑制剂（H89）、H89+ZAG、p38MAPK抑制剂（SB203580）和SB203580+ZAG。应用RT-PCR法检测过氧化物酶增殖型受体γ辅助活化因子1α（PGC-1α）、核呼吸因子1/2（NRF-1/2）、线粒体转录因子A（mtTFA）的表达水平。结果: RT-PCR法显示ZAG促进线粒体生物合成相关因子的表达,PKA特异性抑制剂H89和p38MAPK特异性抑制剂SB203580抑制线粒体生物合成相关因子的表达,而H89+ZAG和SB203580+ZAG处理细胞则抑制ZAG对线粒体生物合成相关因子的促进作用。结论:ZAG能够促进线粒体生物合成相关因子的表达,这种作用可能是通过PKA和p38MAPK信号通路介导。