论文摘要
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是中老年人常见的神经退行性疾病,在临床上以静止性震颤、肌张力增高、运动迟缓和步态异常为特征。主要病理基础是中脑黑质致密部（SNpc）多巴胺能神经元选择性进行性退变,继而引起纹状体多巴胺（DA）严重缺乏。由于PD的病因不清,至今尚无完善的治疗方案,不论药物治疗和手术治疗都只能缓解症状,而不能阻止受损伤的DA能神经元的继续退变、死亡,且均有不同程度的不良反应。因此探寻无创、避免不良反应的新疗法是当前神经科学研究的热点。PD的确切病因机制尚未探明,近年来发现神经营养因子（NTFs）与PD的发病密切相关,认为各种NTFs的缺乏可能是黑质神经元退变的原因。而在对中脑黑质DA能神经元（NDN）有作用的NTFs当中,以胶质细胞系源性神经营养因子（GDNF）和脑源性神经营养因子（BDNF）的效应更强。而在PD病人的黑质区这两种NTFs的表达减少。因此,能够上调黑质BDNF、GDNF表达的方法可能是治疗PD的有效策略。重复经颅磁刺激（rTMS）为刺激大脑皮质神经元的一种新的、非侵入性、无痛的治疗手段,当给予一组或一个序列的脉冲时,能够调节局部或远隔神经元的活动。近年来已做为神经心理疾病如PD、运动失调和抑郁等疾病的有潜力的治疗性工具。研究显示高频（>1 Hz）或低频（<1 Hz）rTMS均可改善PD的运动功能,临床应用低频刺激较高频刺激更安全,然而这种治疗性作用的机制尚不清楚。研究表明rTMS治疗PD的原理可能与其调节大脑皮质兴奋性有关,即高频增加皮质的兴奋性,而低频抑制皮质的兴奋性,另外可能还与增加纹状体内DA的释放有关。最近Funamizu等研究表明高频rTMS对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）致大鼠黑质多巴胺能神经元的损伤具有神经保护作用,但未阐明具体的作用机制。Müller等报道长期高频rTMS可以增加大鼠特定脑区的BDNF表达而发挥神经保护作用。那么,低频rTMS是否通过促进PD小鼠中脑GDNF和BDNF的表达而发挥其对黑质多巴胺能神经元的保护效应?本课题拟应用MPTP诱导的PD小鼠模型,分别应用行为学检测、电生理技术、高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ECD）、免疫组织化学和免疫印迹分析技术,观察低频rTMS对MPTP致PD模型小鼠运动功能、皮质兴奋性、神经生化和神经病理学方面的影响,观察低频rTMS是否对MPTP诱导的PD小鼠具有治疗作用,并探讨低频rTMS对MPTP致PD模型小鼠NDN的神经保护作用及其可能的作用机制。第一部分:低频rTMS对PD模型小鼠行为学的影响目的:通过行为学检测,观察不同时间点低频rTMS对PD小鼠模型运动功能的影响。方法:56只雄性C57BL/6J小鼠随机分为:盐水对照组（NS）,PD模型组（PD）,假磁刺激组（s-rTMS）,磁刺激组（rTMS）,每组14只。小鼠皮下注射MPTP（15 mg/kg/2 h,注射4次）复制急性PD模型,末次注射24 h后对rTMS组小鼠进行rTMS干预（刺激强度为1特斯拉（T）,频率1 Hz,刺激5个序列,每个序列刺激25次,每个序列之间间隔2 min,每天刺激一次,连续14 d）;s-rTMS组置于相同环境,但不接受磁刺激;NS组和PD组不予以任何处理。（1）观察小鼠的一般行为学表现。（2）利用rotarod实验方法记录小鼠在注射前（MPTP或NS）及末次注射（MPTP或NS）后1 d（24 h）、3、7、14 d于滚轴上停留的转数,观察低频rTMS对小鼠身体协调能力的影响。（3）利用小鼠自由活动仪记录其在注射前（MPTP或NS）及末次注射（MPTP或NS）后1 d（24 h）、3、7、14 d记录自由活动次数,观察低频rTMS对小鼠自由活动能力的影响。结果:1一般行为学观察:小鼠在每次注射MPTP后很快出现震颤、竖尾、竖毛、后肢张开、步态不稳,随着给药次数的增加,其运动减少、肢体僵硬、步态不稳、反应迟缓的表现越来越明显。每次给药后上述急性中毒症状持续5～6小时,在24小时后基本恢复。Rotarod实验结果显示:（1）各实验组内在不同时间点的比较:①NS组:在NS注射前及末次注射后1、3、7、14 d,小鼠在转杆上的旋转次数各时间点间比较差异均无统计学意义（p>0.05）。②PD及s-rTMS组:分别与在MPTP注射前相比,在MPTP末次注射后1 d,小鼠在转杆上的旋转次数均明显下降（91.54±4.95 vs 43.14±5.55, 90.26±4.39 vs 41.39±4.39, p<0.01）;随着时间的延长,小鼠在转杆上的旋转次数有一轻度增加趋势,在MPTP末次注射后3、7、14 d,分别为（60.86±4.36）、（62.49±3.97） , （68.57±5.4）、（66.09±4.549）和（73.14±4.74）、（70.73±5.2）,在前3 d增加稍快,之后变得较平缓。③rTMS组:在MPTP末次注射后1 d（rTMS第1 d）,小鼠在转杆上的旋转次数较rTMS前明显下降（91.11±4.34 vs 41.18±6.0, p<0.01）;与rTMS第1 d相比,在MPTP末次注射后3、7、14 d（rTMS第3、7、14 d）,小鼠在转杆上的旋转次数有一明显增加趋势（64.57±5.5, 80.49±4.56, 85.89±3.74, p<0.01）。（2）组间比较:PD组、s-rTMS组及rTMS组小鼠停留于滚轴上的旋转次数显著低于NS组（p<0.001）;rTMS组小鼠停留于滚轴上的旋转次数显著高于s-rTMS组（p<0.001）,s-rTMS组与PD组比较差异无统计学意义（p>0.05）。2小鼠自主活动结果显示:（1）各实验组内在不同时间点的比较:①NS组:NS注射前及末次注射后1、3、7、14 d,自主活动记数各时间点间比较差异均无统计学意义（p>0.05）。②PD、s-rTMS和rTMS组:MPTP末次注射后1 d,小鼠自主活动记数较MPTP注射前均明显下降（133.59±6.16 vs 78.12±8.04, 129.61±6.88 vs 77.07±7.13和132.16±7.12 vs 80.49±6.59, p<0.01）,但在MPTP末次注射后3、7、14 d,自主活动基本恢复到MPTP注射前状态,差异均无统计学意义（p>0.05）。（2）组间比较:PD组、s-rTMS组及rTMS组小鼠自由活动次数显著低于NS组（p<0.001）。rTMS与PD、s-rTMS组自由活动次数比较差异无统计学意义（p>0.05）。小结:该研究中应用的MPTP注射方案,能够成功建立急性PD小鼠模型,MPTP可诱导PD小鼠出现与PD患者相似的行为缺陷,主要表现为运动协调能力的下降;低频rTMS可改善PD小鼠的运动协调性,进一步证实了rTMS可以改善PD患者的运功功能的理论。第二部分:低频rTMS对PD模型小鼠大脑皮质兴奋性的影响目的:通过静息运动阈值（RMT）的检测,观察低频rTMS对PD小鼠模型大脑皮质兴奋性的影响方法:32只雄性C57BL/6J小鼠随机分为:盐水对照组（NS）,PD模型组（PD）,假磁刺激组（s-rTMS）,磁刺激组（rTMS）,每组8只。小鼠皮下注射MPTP（15 mg/kg/2 h,注射4次）复制急性PD模型,末次注射24 h后对rTMS组小鼠进行rTMS干预（刺激频率为1Hz,刺激强度1 T,每次刺激25秒,刺激5个序列,每天刺激一次,连续14 d）,s-rTMS组置于相同环境,但不接受磁刺激,NS组和PD组不予以任何处理。静息运动阈值（RMT）的检测:分别于注射前（MPTP或NS）及末次注射（MPTP或NS）后1 d（24 h）、3、7、14 d进行RMT的检测。结果:1各实验组内不同时间点间的比较:①NS组:在NS注射前及末次注射后1、3、7、14 d,RMT各时间点间比较均无差异统计学意义（p>0.05）。②PD、s-rTMS组:分别与MPTP注射前相比,在MPTP末次注射后1 d,小鼠的RMT均明显下降（25.13±2.03 vs 22.38±1.41, 25±2 vs 21.88±1.36, p<0.05）;在MPTP末次注射后3、7、14 d,两组小鼠的RMT继续有一轻度下降趋势（21.88±1.73）、（21.25±1.49）,（21.38±1.92）、（21±2.27）和（21.25±1.39）、（20.88±1.81）,但变化较平缓。③rTMS组:与MPTP注射前相比,在MPTP末次注射后1 d（rTMS第1 d）,小鼠的RMT明显下降(（24.88±2.03 vs 21.75±1.98）（p<0.05）;与rTMS第1 d相比,在MPTP末次注射后3 d（rTMS第3 d）,小鼠的RMT有一定的的增加（22.88±2.23）,但差异无统计学意义（p>0.05）,在rTMS第7、14 d,小鼠的RMT明显增加（23.5±1.51 ）、（23.88±1.64）（p<0.05）。2组间比较:PD组、s-rTMS组及rTMS组RMT值显著低于NS组（p<0.001）。但rTMS组RMT值与PD组及s-rTMS组比较显著增高（p<0.01）,PD与s-rTMS组比较差异无统计学意义（p>0.05）。小结:MPTP致PD小鼠的RMT降低,运动皮质兴奋性增加;低频rTMS能够抑制PD小鼠增加的运动皮质兴奋性,提示运动皮质可能是rTMS治疗PD的有效靶点,由此为临床上应用低频rTMS治疗PD病人提供了电生理学方面的依据。第三部分:低频rTMS对帕金森病小鼠纹状体DA及其代谢产物的影响目的:应用HPLC-ECD法观察低频rTMS对PD小鼠的纹状体内DA及其代谢产物高香草酸（HVA）、二羟苯乙酸（DOPAC）含量的影响。方法:24只雄性C57BL/6J小鼠随机分为:盐水对照组（NS）,PD模型组（PD）,假磁刺激组（s-rTMS）,磁刺激组（rTMS）,每组6只。小鼠皮下注射MPTP（15 mg/kg/2 h,注射4次）复制急性PD模型,末次注射24 h后对rTMS组小鼠进行rTMS干预（刺激频率为1 Hz,刺激强度1 T,每次刺激25秒,刺激5个序列,每天刺激一次,连续14 d）,s-rTMS组置于相同环境,但不接受磁刺激;NS组和PD组不予以任何处理。最后一次刺激24 h后,在行为学检测后,小鼠被断颈处死取新鲜脑纹状体组织。应用HPLC-ECD法测定纹状体内DA、HVA及DOPAC的含量。结果:与NS组比较,PD组小鼠纹状体DA含量显著降低（151.26±38.46 vs 515.44±90.02）,差异具有统计学意义（p<0.01）,DA下降幅度为70.65%,DA代谢产物HVA及DOPAC含量也显著降低（809.91±121.88 vs 593.34±36.45, 1180.11±641.25 vs 409.03±275.6）,差异具有统计学意义（p<0.01）。与s-rTMS组比较,rTMS组小鼠纹状体DA、HVA及DOPAC含量明显增加（185.98±40.7 vs 258.21±50.35, 622.69±50.95 vs 711.89±54.02, 386.84±192.95 vs 936.8±373.61）,差异具有统计学意义（p<0.05）。以上DA、HVA及DOPAC含量各指标在PD组与s-rTMS组之间差异无统计学意义（p >0.05）。小结:该研究中采用的MPTP注射方案导致PD小鼠纹状体内DA及其代谢产物显著降低,表现为与临床PD患者相似的生化特征;低频rTMS可能通过增加PD小鼠纹状体DA及其代谢产物含量而发挥其治疗作用。第四部分:低频rTMS对帕金森病小鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用及其机制目的:探讨低频rTMS对MPTP诱导的PD小鼠模型NDN的保护作用及其可能的作用机制。方法:56只雄性C57BL/6J小鼠随机分为:盐水对照组（NS）, PD模型组（PD）,假磁刺激组（s-rTMS）,磁刺激组（rTMS）,每组14只。小鼠皮下注射MPTP（15 mg/kg/2 h,注射4次）复制急性PD模型,末次注射24 h后对rTMS组小鼠进行rTMS干预（刺激频率为1Hz,刺激强度1T,每次刺激25秒,刺激5个序列,每天刺激一次,共14 d）。最后一次刺激24 h后,在行为学检测后,每组取8只进行脑灌注固定,然后取中脑行连续冠状冰冻切片,进行黑质区酪氨酸羟化酶免疫反应阳性（TH-ir）、脑源性神经营养因子免疫反应阳性（BDNF-ir）及胶质源性神经营养因子免疫反应阳性（GDNF-ir）细胞的免疫组织化学分析;另外每组取6只用于断头取脑SN活组织,进行黑质区TH、BDNF及GDNF蛋白的Western blot分析,并借助图像分析系统对所有指标进行定量。结果:1免疫组织化学染色结果:（1）TH免疫组织化学染色结果显示:NS组SNc区TH-ir细胞密集,着色深,突起较长;与NS组比较,PD组SNc区TH-ir细胞数量明显减少（71.88±4.26 vs 31.67±3.35）,差异具有统计学意义（p<0.01）,减少比例为55.94%,胞浆着色浅,分布较稀疏,有些细胞可见皱缩,突起较短,PD组相应的COD值亦明显降低（0.3321±0.036 vs 0.2196±0.0182）,差异具有统计学意义（p<0.01）。与s-rTMS组比较,rTMS组SNc区TH-ir细胞计数、COD值均明显增加（32.45±3.31 vs 36.67±3.82, 0.2259±0.0292 vs 0.2795±0.0258）,差异具有统计学意义（p<0.05）,胞浆着色较深,分布较密集。以上各指标在s-rTMS组与PD组之间差异无统计学意义（p>0.05）。（2）BDNF免疫组织化学染色结果显示:NS组SNc区BDNF-ir细胞密集,着色深;与NS组比较,PD组SNc区BDNF-ir细胞数及COD值均明显减少（92.85±7.61 vs 62.99±5.97, 0.3180±0.0224 vs 0.2793±0.0220）,差异无统计学意义（p<0.01）,胞浆着色浅,分布较稀疏;与s-rTMS组比较,rTMS组SNc区BDNF-ir细胞计数、COD值均明显增加（61.63±6.61 vs 70.20±6.12, 0.2842±0.0195 vs 0.3069±0.0203）,差异具有统计学意义（p<0.05）,着色较深,分布较密集;以上各指标在s-rTMS组与PD组之间差异无统计学意义（p>0.05）。（3） GDNF免疫组织化学染色结果:NS组黑质区GDNF-ir细胞密集,着色深;与NS组比较,PD组黑质区阳性细胞数及COD值均明显减少（100.11±9.66 vs 73.22±7.77, 0.3381±0.0304 vs 0.4169±0.0270）,差异具有统计学意义（p<0.01）,胞浆着色浅,分布较稀疏;与s-rTMS组比较,rTMS组黑质区GDNF-ir细胞计数、COD值明显增加（74.48±7.84 vs 84.2±9.65, 0.3414±0.0360 vs 0.3761±0.0267）,差异具有统计学意义（p<0.05）,染色较深,分布较密集;以上各指标在s-rTMS组与PD组之间差异无统计学意义（p>0.05）。（4）相关性分析:各组小鼠黑质区SN区TH-ir与BDNF-ir细胞计数及其相应的COD值呈明显正相关（p<0.05）。各组SN区TH-ir与GDNF-ir细胞计数及相应的COD值也呈明显正相关（p<0.05）。2 Western blot结果:（1）TH蛋白Western blot分析结果显示:与NS组比较,PD组的TH条带明显淡化,ROD值明显下降（0.8443±0.0797 vs 0.6893±0.0675）,差异具有统计学意义（p<0.01）;与s-rTMS组比较,rTMS组TH条带明显加深,ROD值明显增加（0.6978±0.0988 vs 0.8074±0.0702）,差异具有统计学意义（p<0.05）,在s-rTMS组与PD组之间TH条带ROD值差异无统计学意义（p>0.05）。（2）BDNF蛋白Western blot分析结果显示:BDNF蛋白,表现为相对分子质量为18kD（单体, BDNF-monomer）和相对分子质量为30kD的两条条带（同源二聚体, BDNF-homodimer）。与NS组比较,PD组的BDNF-monomer及BDNF-homodimer条带明显变淡,ROD值均明显下降（0.988±0.0656 vs 0.815±0.0373,0.972±0.0907 vs 0.772±0.0621）,差异具有统计学意义（p<0.01）;与s-rTMS组比较,rTMS组BDNF-monomer及BDNF-homodimer条带明显加深,ROD值均明显增加（0.792±0.0598 vs 0.905±0.0983, 0.792±0.07 vs 0.893±0.0952）,差异具有统计学意义（p<0.05）;在s-rTMS组与PD组之间BDNF-monomer及BDNF-homodimer蛋白表达则差异均无统计学意义（p>0.05）。（3）GDNF蛋白Western blot结果显示:与NS组比较,PD组的GDNF蛋白条带明显淡化,ROD值明显下降（0.872±0.0652 vs 0.697±0.0914）,差异具有统计学意义（p<0.01）;与s-rTMS组比较,rTMS组GDNF蛋白条带明显加深,ROD值明显增高（0.684±0.0130 vs 0.843±0.0879）,差异具有统计学意义（p<0.05）;在s-rTMS组与PD组之间GDNF蛋白条带ROD值差异无统计学意义（p>0.05）。（4）相关性分析显示:各组小鼠黑质区TH与BDNF-monomer或BDNF-homodimer蛋白表达呈明显正相关（p<0.05）,TH与GDNF蛋白表达也呈明显正相关（p<0.05）。小结:1该研究中应用的MPTP注射方案确能选择性损伤NDN,符合PD的典型病理特征;2低频rTMS能够防止MPTP诱导的NDN的退变,明显增加PD小鼠黑质区TH的表达水平,其机制可能是与上调黑质区BDNF和GDNF蛋白的表达水平有关。结论C57BL/6J小鼠皮下注射MPTP每次15 mg/kg,连续注射4次,每次间隔2小时,能够成功建立急性PD小鼠模型。本研究中应用的rTMS设计方案（刺激频率为1Hz,刺激强度1T,每次刺激25秒,刺激5个序列,每天刺激一次,共14 d）可能通过抑制增加的皮质兴奋性、减缓或防止NDN的变性、缺失和促进纹状体DA的合成或释放对PD小鼠产生有益的效应。研究表明低频rTMS对黑质多巴胺能神经元具有保护作用,而这可能部分与rTMS诱导黑质区BDNF和GDNF蛋白表达水平增加有关。本实验能够为低频rTMS在PD患者的临床治疗和康复提供一定的理论依据,rTMS可以做为PD患者治疗或辅助治疗的一种有价值的手段。
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