花粉介导与农杆菌介导果树转基因初探

论文摘要

本研究选用苹果品种嘎拉与葡萄品种玫瑰香和瑰宝为试材,选用曹秋芬等于2003年分离克隆的苹果LEAFY同源基因AFL1和AFL2,采用花粉介导附加超声波法和农杆菌介导法进行基因遗传转移的初步研究。探讨花粉介导转化方法在果树上的可行性,并根据苹果和葡萄的生物学特性对转化过程中的限制因素进行试验,选出适合苹果和葡萄花粉的缓冲液,对超声波处理苹果和葡萄花粉的基本参数进行选择。另外,通过研究影响农杆菌介导苹果遗传转化的因素,建立了嘎拉苹果离体叶片高效植株再生培养体系,探讨影响农杆菌介导法基因转移效率的主要因子。结果如下: 1.通过探讨苹果（Malus pumila Mill）花粉介导附加超声波处理对苹果品种丹霞和嘎拉花粉的影响,结果筛选出了适合苹果花粉处理的缓冲液pH值为5.4、蔗糖浓度为10%;结果也表明超声波处理功率、时间、次数等各参数对苹果花粉的萌发率和破碎率有显著影响。GUS活性检测结果,花粉有百分之八的转化率。 2.利用花粉介导附加超声波处理了葡萄（Vitis vinifera L.）花粉,结果表明超声波处理各参数对葡萄花粉有极显著影响,而且参数间存在交互作用,因此用超声波处理花粉选择处理参数时应考虑其交互作用。考察显著性检验结果,在试验花粉破碎率和萌发率的稳定性和不破坏DNA的基础上,超声波处理参数以功率100W～120W,处理时间4s～5s,间隙时间2s～6s,处理次数6为最佳组合选择范围。GUS活性检测结果,花粉有千分之四的转化率。通过所选参数在葡萄上进行转化试验,共获得了杂交苗578株。 3.通过分析培养基中激素、暗培养、叶片放置方式对苹果品种嘎拉叶片再生的影响,确立了苹果离体叶片高效再生体系,在含BA 5 mg/L+IAA 0.5 mg/L的MS培养基上,以离体叶片远轴面（叶背面）向上,经过14天的暗培养获得再生不定芽和再生植株,再生率达97%。 4.研究不同抗生素对不定芽再生的影响,优化确定了选择压。在嘎拉苹果转化体系中,用400 mg/L的头孢菌素和5mg/L的卡那霉素,作为脱菌培养和选择培养中的脱菌浓度和选择压。已初步获得抗性愈伤和抗性苗。

论文目录

• 摘要
• 1 前言
• 1.1 果树遗传转化研究进展
• 1.1.1 果树的遗传转化途径
• 1.1.2 影响果树转基因效率的因素
• 1.1.3 遗传转化在果树上的应用现状
• 1.2 植物开花基因及童期调控研究进展
• 1.3 本研究的立题依据及意义
• 2 花粉介导苹果转基因技术
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 缓冲液
• 2.1.3 质粒提取
• 2.1.4 超声波处理
• 2.1.5 GUS检测
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 缓冲液选择
• 2.2.2 超声波处理参数的选择
• 2.2.3 GUS检测
• 2.3 讨论
• 3 花粉介导葡萄转基因技术
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 缓冲液
• 3.1.3 质粒提取
• 3.1.4 超声波处理
• 3.1.5 GUS检测
• 3.1.6 葡萄转化
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 超声波处理参数的选择
• 3.2.2 GUS检测
• 3.2.3 葡萄转化结果
• 3.3 讨论
• 4 农杆菌介导苹果转基因研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 苹果离体叶片再生系统的建立
• 4.1.2 农杆菌介导苹果转化体系的确立
• 4.1.3 转基因植株的PCR鉴定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 苹果离体叶片再生系统的建立
• 4.2.2 抗生素对离体叶片再生频率的影响
• 4.2.3 农杆菌转化结果
• 4.3 讨论
• 4.3.1 关于影响苹果离体叶片再生的因子
• 4.3.2 关于苹果转化的选择培养
• 4.3.3 关于苹果的脱菌培养
• 5 研究总结
• 5.1 花粉介导苹果转基因技术
• 5.2 花粉介导葡萄转基因技术
• 5.3 农杆菌介导苹果转基因研究
• 参考文献
• Abstract
• 附图
• 致谢