氯噻啉酶联免疫吸附分析方法研究

论文摘要

本研究为探讨新烟碱类杀虫剂免疫化学分析的基本规律并应用于农药残留分析,以新烟碱类杀虫剂氯噻啉为研究对象,建立了氯噻啉的间接竞争ELISA法,并应用于环境和农产品样品中氯噻啉残留检测。合成了氯噻啉半抗原,通过碳二亚胺法将半抗原偶联于牛血清蛋白（BSA）制备了免疫抗原,通过混合酸酐法偶联于卵清蛋白（OVA）制备了包被抗原,免疫新西兰大白兔和BALB/c小鼠获得相应的多克隆抗体和单克隆抗体。当包被抗原的浓度为4mg/L时,多克隆抗体和单克隆抗体的抗体的效价分别达2.56×106和5.12×106。对ELISA方法中的影响因素（有机溶剂含量、盐离子浓度、pH）进行了研究,确定ELISA反应的最佳工作条件。基于多克隆抗体的ELISA法的最佳工作条件为：包被原和抗体的最佳工作浓度分别为0.5 mg/L和0.4mg/L,最佳反应体系为10%的甲醇含量、pH 7.4以及0.14 mol/LNa+强度的磷酸盐缓冲溶液。在间接竞争酶联免疫分析的最佳检测条件下建立了氯噻啉标准竞争曲线,该方法的抑制中浓度为0.18 mg/L,最低检测限为0.0018mg/L。除与吡虫啉有较大的交叉反应外,与其他结构相似的化合物无明显交叉反应。在水、土壤和甘蓝中分别添加0.05-1mg/kg的氯噻啉标准溶液,平均回收率为91.42%-113.82%,变异系数为0.72%-8.68%,符合农药残留检测要求。基于单克隆抗体ELISA法的最佳工作条件为：包被原和抗体的最佳工作浓度分别为0.65mg/L和0.4mg/L,最佳反应体系为10%的甲醇含量、pH 7.4和0.14 mo1/L的Na‘强度的磷酸盐缓冲溶液。在最佳检测条件下建立氯噻啉标准竞争曲线,该方法的抑制中浓度为0.088mg/L,最低检测限为0.018mg/L。除与吡虫啉有较大的交叉反应外,与其他结构相似的化合物无明显交叉反应。在水、土壤和甘蓝中分别添加0.05-0.5mg/kg的氯噻啉标准溶液,平均回收率为80.43%-113.83%,变异系数为1.08%-8.92%,符合农药残留检测要求。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 第一章 文献综述
• 1 农药残留及农药残留检测技术
• 1.1 农药残留概念
• 1.2 农药残留研究内容与目的
• 1.3 农药残留检测技术研究进展
• 2 酶联免疫分析技术
• 2.1 免疫分析技术发展历史
• 2.2 免疫分析方法基本原理及分类
• 2.3 酶联免疫分析方法技术要点
• 2.4 酶联免疫技术（ELISA）类型及操作步骤
• 2.5 酶联免疫分析检测技术的主要影响因素
• 3 新烟碱类杀虫剂概况
• 3.1 烟碱类杀虫剂发展历史
• 3.2 烟碱类杀虫剂结构与作用机理
• 3.3 烟碱类杀虫剂残留检测概述
• 4 ELISA在烟碱类杀虫剂中的应用
• 4.1 半抗原设计
• 4.2 ELISA检测方法在新烟碱类杀虫剂中的应用
• 5 论文研究目的意义、内容、技术路线
• 5.1 研究目的及意义
• 5.2 研究内容
• 5.3 技术路线
• 第二章 氯噻啉人工抗原的合成
• 1 试验材料
• 1.1 试验试剂
• 1.2 缓冲溶液
• 2 试验方法
• 2.1 半抗原的合成
• 2.2 免疫抗原与包被抗原的制备与鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 半抗原分子的结构鉴定
• 3.2 人工抗原偶联物结合比的测定
• 第三章 基于多克隆抗体的氯噻啉酶联免疫吸附分析方法研究
• 1 试验材料
• 1.1 试验试剂
• 1.2 缓冲溶液
• 1.3 试验仪器
• 2 试验方法
• 2.1 免疫方案
• 2.2 采血与测定
• 2.3 抗体纯化
• 2.4 抗体效价测定及工作浓度选择
• 2.5 间接竞争ELISA程序
• 2.6 条件优化及标准曲线的建立
• 2.7 标准曲线的建立和线性范围的考察
• 2.8 交叉反应率的测定
• 2.9 添加回收率的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 多克隆抗体的效价和工作浓度选定
• 3.2 氯噻啉ELISA法的条件优化
• 3.3 氯噻啉标准曲线的建立
• 3.4 抗体特异性分析（交叉反应）
• 3.5 添加回收率的测定
• 第四章 基于单克隆抗体的氯噻啉酶联免疫吸附分析方法研究
• 1 试验材料
• 1.1 试验试剂
• 1.2 缓冲溶液
• 1.3 试验仪器
• 2 试验方法
• 2.1 单克隆抗体的制备与纯化
• 2.2 抗体效价测定及工作浓度选择
• 2.3 间接竞争ELISA程序
• 2.4 条件优化及标准曲线的建立
• 2.5 标准曲线的建立和线性范围的考察
• 2.6 交叉反应率的测定
• 2.7 添加回收率的测定
• 3 结果与分析
• 3.1 小鼠血清效价测定及细胞株系的建立
• 3.2 单克隆抗体的效价和工作浓度选定
• 3.3 氯噻啉ELISA法的条件优化
• 3.4 氯噻啉标准曲线的建立和交叉反应率的测定
• 3.5 添加回收率的测定
• 第五章 全文讨论
• 1 人工抗原的合成
• 2 单克隆抗体与多克隆抗体的比较
• 3 最佳工作浓度选择
• 4 条件优化及分析方法的建立
• 4.1 甲醇含量
• 4.2 离子强度
• 4.3 pH值
• 5 特异性分析（交叉反应）
• 6 免疫检测方法与传统检测方法比较
• 第六章 全文结论
• 1 全文结论
• 2 本论文创新点
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录