玉米温敏自交不亲和系HE97的生态学遗传机理研究及相关基因的克隆

论文摘要

本研究对玉米温敏自交不亲和材料（TGSI）HE97的生态学机制、遗传机理进行了研究,并对亲和相关基因进行了克隆与功能分析。利用分期播种和田间叶龄调查的方法,对HE97的亲和性转换机制进行了研究,结果表明,HE97亲和性转换的敏感时期是雄穗小花分化期（雌穗生长锥伸长期）,主要受日最低温度的影响,属于温敏型自交不亲和,其亲和性转换的温度区间为20-24℃。当最低温度低于20℃时表现不亲和,最高温度高于24℃时表现亲和,与日照时数不存在显著的相关关系。通过对HE97与郑58的F2群体进行QTLs分析,在第二染色体上检测到一个影响自交不亲和的主效QTL,贡献率为21.37%,位于SSR标记umc1635和nc133之间;该基因在F2:3群体中能同时检测到,贡献率为16.8%。经典遗传学分析与数量性状基因定位结果均表明HE97的自交不亲和特性由1对隐性基因控制,命名为tgsi1,并通过BSA分池的方法将该基因定位在第二染色体上,与SSR标记nc131的遗传距离为2.4cM,与bnlg1633之间的遗传距离为2.4cM。在本课题研究的基础上,从HE97亲和花丝与不亲和花丝的正向差减文库中挑选了一个与水稻CIPKs高度同源的玉米类CIPKs基因,利用3’RACE技术和生物信息学方法对该基因进行了克隆（在GenBank上的登陆号是EU424058）。该候选基因cDNA为1918bp,基因组DNA为2520bp,包含一个1332bp的开放阅读框,编码443个氨基酸,功能域分析表明靠近N端有一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域和一个保守的NAF结构域,BLAST分析发现,该基因与水稻、黑三角叶杨、高粱等生物体的CIPKs基因有很高的相似性。建立了SYBR Green法实时荧光定量RT-PCR表达分析系统,研究了该基因在不同植物组织间表达量差异,结果发现,玉米候选基因类CIPKs基因在根、茎、叶、花丝、花粉中均有表达,其中在不亲和花粉中表达量最高,在亲和花丝中的表达量高于不亲和花丝中的表达量,与SSH结论一致。由于类CIPKs基因在不亲和花粉中高表达量直接诱导了不亲和花粉中Ca2+浓度的增加,可以阻止花粉在柱头的萌发或抑制花粉管的生长,由此该基因在温敏自交不亲和特性发生过程中可能起到了第二信号因子的作用。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 第一章 文献综述
• 1 禾本科植物自交不亲和性及机理研究进展
• 1.1 植物自交不亲和性的普遍性和分类
• 1.2 孢子体自交不亲和的分子机理及研究进展
• 1.2.1 孢子体自交不亲和表现
• 1.2.2 孢子体自交不亲和雌雄S 决定子的鉴定过程及跨膜信号转导
• 1.3 配子体自交不亲和的分子机理及研究进展
• 1.3.1 以S-RNase 为基础的SI 信号转导的研究进展
• 1.3.1.1 SI 信号分子—S-RNase
• 1.3.1.2 信号分子的接受体——花粉S 蛋白
• 1.3.1.3 以S-RNase 为基础的细胞信号转导途径
• 1.3.2 罂粟科SI 信号转导的研究进展
• 1.4 禾本科自交不亲和性机理
• 1.5 玉米生态核雄性不育的研究进展
• 1.6 自交不亲和在农作物种子生产中的应用
• 2 蛋白质磷酸化
• 3 基因克隆
• 3.1 概述
• 3.2 RACE 的基本原理
• 3.3 RACE 与生物信息学资源的结合——“电子”cDNA 文库筛选
• 3.4 候选基因的功能验证
• 第二章 玉米温敏自交不亲和性的生态学机制研究
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 HE97 亲和性转换机制的田间鉴定试验
• 1.3 光照处理实验
• 1.3.1 实验地点及处理
• 1.3.2 田间试验设计
• 1.3.3 田间调查及数据记录
• 2 结果与分析
• 2.1 生态型自交不亲和系HE97 的形态学鉴定
• 2.2 HE97 的亲和性转换区间与光温因子的关系分析
• 2.3 不同光照处理对HE97 结实性的影响
• 3 讨论
• 第三章 玉米温敏自交不亲和基因的定位
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 田间试验
• 1.3 遗传连锁图的构建及基因定位
• 1.3.1 DNA 的提取
• 1.3.2 PCR 扩增及扩增产物检测步骤
• 1.3.3 遗传连锁图谱的构建与QTL 分析
• 1.3.4 目标基因的定位
• 2 结果与分析
• 2群体的田间亲和性表现'>2.1 F₂群体的田间亲和性表现
• 2.2 遗传连锁图谱构建与QTL 分析
• 2.3 目标性状的质量基因定位
• 3 讨论
• 第四章 玉米温敏自交不亲和相关基因类CIPKS 的克隆及表达分析
• 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 实验材料的种植、取样和鉴定
• 1.2.2 总RNA 的抽提
• 1.2.3 RNA 含量和质量的检测
• 1.2.4 3’端基因序列扩增
• 1.2.4.1 cDNA 第一链的合成
• 1.2.4.2 第一次 PCR 扩增
• 1.2.4.3 第二次PCR 扩增
• 1.2.4.4 电泳检测
• 1.2.4.5 PCR 产物的纯化
• 1.2.4.6 PCR 产物的连接和转化
• 1.2.4.7 PCR 检测阳性克隆
• 1.2.4.8 DNA 序列测定和分析
• 1.2.5 类CIPKs 基因生物信息学分析
• 1.2.5.1 类CIPKs 基因的EST 序列电子延伸
• 1.2.5.2 Contig1E6 PCR 扩增
• 1.2.5.3 PCR 产物的纯化：同1.2.4.5
• 1.2.5.4 PCR 产物的连接与转化：同1.2.4.6
• 1.2.5.5 PCR 检测阳性克隆：同1.2.4.7
• 1.2.5.6 重组质粒的提取和鉴定
• 1.2.5.7 测序
• 1.2.6 基因组DNA 扩增
• 1.2.6.1 PCR 产物的纯化：同1.2.4.5
• 1.2.6.2 PCR 产物的连接与转化：同1.2.4.6
• 1.2.6.3 PCR 检测阳性克隆：同1.2.4.7
• 1.2.6.4 测序
• 1.2.7 差异表达基因类CIPKs 基因的实时荧光定量PCR
• 1.2.7.1 逆转录反应
• 1.2.7.2 引物设计和标准曲线的建立
• 1.2.7.3 荧光定量PCR 体系和数据处理
• 1.2.8 原子吸收分光光度法测量钙浓度
• 2 结果与分析
• 2.1 RNA 的含量和质量测定结果
• 2.2 类 CIPKs 基因 PCR 扩增产物检测
• 2.3 类 CIPKs 基因的生物信息学分析
• 2.3.1 基因结构分析
• 2.3.2 编码蛋白的结构预测
• 2.3.3 类CIPKs 基因与几种植物同源序列氨基酸的比较分析
• 2.3.4 类CIPKs 基因的电子定位
• 2.4 类 CIPKs 基因的定量表达分析
• 2.4.1 标准曲线的建立
• 2.4.2 基因表达的定量检测
• 2.5 原子吸收分光光度法测量钙离子浓度
• 3 讨论
• 参考文献
• 英文摘要