苹果基因组中Tyl-copia反转录转座子的分离鉴定及S-SAP标记体系的建立

论文摘要

反转录转座子在植物界广泛存在,它的高拷贝、高异质性和插入不可逆等特点使其成为基因克隆、生物多样性及系统发育进化研究的重要工具。苹果是世界上广泛栽培的果树,本研究以栽培苹果为试材,在克隆苹果Ty1-copia组反转录转座子RT序列的基础上,探索分离反转录转座子LTR序列及全长序列,采用生物信息学方法对从苹果基因组中分离的4条Ty1-copia组反转录转座子全长序列的基因结构及序列特征进行分析。此外,基于分离的3′端LTR序列,建立了苹果S-SAP标记体系,并利用该标记技术对24个富士芽变无性系和11个元帅芽变无性系进行了鉴定。主要结果如下:1.基于加接头巢式PCR和改进SiteFinding-PCR染色体步移技术能成功从苹果基因组中分离反转录转座子的LTR序列,其中加接头巢式PCR比改进SiteFinding-PCR扩增片段长、成功率高、稳定性好。加接头半巢式简并PCR和特异PCR两种方法不能有效分离苹果反转录转座子LTR序列。以约260 bp的RT基因片段为起点,用加接头巢式PCR技术从苹果基因组中分离出5条Ty1-copia组反转录转座子的3′端LTR序列,利用改进SiteFinding-PCR方法分离出1条Ty1-copia组反转录转座子的3′端LTR序列。2.以约260 bp的RT基因片段为基础序列,利用加接头巢式PCR和改进的SiteFinding-PCR技术,从苹果基因组中分离出4条反转录转座子全长序列,分别命名为Mdtcr1、Mdtcr2、Mdtcr3、Mdtcr4,长度依次为5147 bp、5280 bp、4428 bp和4884 bp。Mdtcr1-Mdtcr4的POL基因编码的蛋白质按PR-INT-RT-RNaseH顺序排列,是典型的Tyl-copia组反转录转座子基因结构,INT、RT和RNaseH区域的蛋白同源性及亲缘关系进一步证明它们属于Ty1-copia组反转录转座子。Mdtcr1-Mdtcr4具有Ty1-copia组反转录转座子不同区域的特征基序,包括GAG区域的C-C-H-C基序,PR区域的D（T/S）G位点,INT区域的H-H-C-C基序,RT区域基序Ⅰ（TAFLHG）、基序Ⅱ（YGLKQ）和基序Ⅲ（YVDDML）,RNaseH区域的基序Ⅰ[KHI（F）D（E）]和基序Ⅱ[A（S）DX2TK],PBS区域特征序列TGGT,PPT位点特征序列AGGGG和LTR边界保守基序5′-TG-CA-3′等。4条序列在ORF的完整性、LTR序列大小及结构上存在异质性。3.调控元件查找表明,从苹果基因组中分离的4条Ty1-copia组反转录转座子的5′端LTR序列包含多种逆境响应元件和激素应答元件,既包括对水分胁迫、低温胁迫、盐胁迫、脱落酸、茉莉酸、赤霉素、水杨酸等单一因素响应的顺式作用元件,也包括对激素和逆境胁迫应答的整合顺式作用元件。4.以富士基因组DNA为模板,基于分离的Ty1-copia组反转录转座子的3′端LTR序列,建立并优化了苹果S-SAP标记体系,从80对引物组合中筛选出10对多态性高、谱带清晰、分布均匀、带型质量好的适于苹果S-SAP分析的引物组合。利用该标记技术对24个富士芽变无性系和11个元帅芽变无性系进行了鉴定,分别有4对（9L/Mtcc、9L/Paat、LTRP1/Mtcc和YLDLTR/Mggt）和3对引物组合（YLDLTR/Paat、9LTR/Mtcc和LTRP1/Mtcc）能鉴别富士芽变无性系和元帅芽变无性系。以相似系数0.88为标准,供试的24个富士芽变无性系经SAHN聚类分为5类:第一类包括长富1、短枝富士、长富3、惠民短富、早富士、岩手1系、长富2、长富6、长富7、烟富3、巨大富士、秋富1、岩富10、宫藤富士、富士Ⅰ系、长富4、昌红和宫崎短枝等18个样品,第二类包括烟富1和2001富士等2个样品,秋富和盛放富1组成第三类,优良短独自成类,富士位于系统树末端。以相似系数0.95为标准,SAHN循环同化阶层聚类分析将11个元帅芽变无性系分为4类:第一类包括红星、艳红、侯家店短红、矮壮、新元帅、唐山丰产元帅、矮威尔和米勒矮生共8个资源,第二类、三类和四类每类只有一个样品,分别是新金短红星、矮红与超红。以遗传相似系数0.75为标尺,富士芽变无性系和元帅芽变无性系各自成类,表明本研究开发的S-SAP技术能有效区分开芽变无性系间和芽变无性系内的供试样品,苹果芽变可能与Ty1-copia组反转录转座子有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物反转录转座子研究概述
• 1.1.1 反转录转座子类型和结构
• 1.1.2 反转录转座子转座机制及活性
• 1.1.3 植物反转录转座子特性
• 1.1.4 反转录转座子与果树芽变
• 1.2 植物反转录转座子应用
• 1.2.1 基于反转录转座子的分子标记及其应用
• 1.2.2 植物反转录转座子在功能基因组学中的应用
• 1.3 本研究的目的意义
• 第二章 苹果TY1-COPIA反转录转座子LTR序列分离方法
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 总DNA的提取及检测
• 2.1.3 反转录转座子RT序列的分离
• 2.1.4 基于改进SiteFinding-PCR染色体步移分离Tyl-copia反转录转座子LTR序列
• 2.1.5 基于加接头巢式PCR染色体步移分离Tyl-copia反转录转座子LTR序列
• 2.1.6 加接头半巢式简并PCR分离Tyl-copia反转录转座子LTR序列
• 2.1.7 特异PCR分离Tyl-copia反转录转座子LTR序列
• 2.1.8 PCR产物检测、回收和克隆
• 2.1.9 序列测定和分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 苹果基因组总DNA提取和质量检测
• 2.2.2 Tyl-copia组反转录转座子RT基因克隆
• 2.2.3 改进SiteFinding-PCR分离Tyl-copia反转录转座子LTR序列
• 2.2.4 加接头巢式PCR分离Tyl-copia反转录转座子LTR序列
• 2.2.5 加接头半巢式简并PCR分离Tyl-copia反转录转座子LTR序列
• 2.2.6 特异PCR分离Tyl-copia反转录转座子LTR序列
• 2.3 讨论
• 2.3.1 苹果Tyl-copia组反转录转座子LTR序列克隆方法
• 2.3.2 加接头巢式PCR关键技术
• 2.4 小结
• 第三章 苹果基因组TY1-COPIA反转录转座子全长分离及序列分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 序列分离及分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 苹果Tyl-copia反转录转座子全长分离
• 3.2.2 苹果Tyl-copia反转录转座子同源性与基因结构
• 3.2.3 苹果Tyl-copia反转录转座子特征序列
• 3.2.4 苹果Tyl-copia反转录转座子不同区域同源性比对及亲缘关系
• 3.2.5 苹果Tyl-copia反转录转座子调控元件
• 3.3 讨论
• 3.3.1 从苹果基因组中获得Tyl-copia组反转录转座子全长序列
• 3.3.2 苹果Tyl-copia组反转录转座子5'端LTR区域调控元件
• 3.3.3 分离的LTR反转录转座子亚组归属
• 3.3.4 关于反转录转座子LTR区域的精确定位
• 3.4 小结
• 第四章 苹果S-SAP分子标记体系建立及其应用
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 接头及引物
• 4.1.3 总DNA提取及浓度调节
• 4.1.4 DNA的酶切与连接
• 4.1.5 PCR扩增
• 4.1.6 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离差异片段
• 4.1.7 谱带统计及数据分析
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 苹果S-SAP分析技术体系建立
• 4.2.2 苹果S-SAP分析引物筛选
• 4.2.3 苹果芽变无性系S-SAP分子标记分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 苹果S-SAP技术体系的建立及优化策略
• 4.3.2 苹果芽变无性系S-SAP分析多态性机制
• 4.4 小结
• 第五章 结论及创新点
• 5.1 结论
• 5.2 创新点
• 5.3 下一步研究思路
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位论文期间发表文章