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鸡输卵管特异性启动子的优化研究

2020-12-11阅读(520)

鸡输卵管特异性启动子的优化研究

论文摘要

转基因动物技术研究从上世纪70年代开始,到目前已经取得了巨大成就,其中生物反应器是转基因动物技术应用研究的热点之一。利用哺乳动物乳腺生物反应器来生产蛋白类药物取得了许多进展,家禽输卵管生物反应器由于禽类突出的产蛋能力等优势也成为各国研究和投资的重点,而如何实现外源蛋白基因在家禽输卵管中高效、特异表达是该研究领域的主要技术瓶颈之一。本试验选取鸡卵清蛋白启动子作为研究对象,从以下几个方面进行了研究：1、白来航鸡卵清蛋白启动子5’端调控序列OVs的克隆采用PCR技术成功克隆了含白来航鸡卵清蛋白启动子5’端调控区的六个不同长度的序列（OV1-OV6）,大小分别为959bp,1381bp,2081bp,3140bp,5474bp和6293bp。序列分析结果显示所扩增的片段包含了目前已知鸡卵清蛋白5’端调控序列中的核心启动子区域。2、卵清蛋白启动子-荧光素酶报告基因重组载体系列的构建将以上六种序列分别构建入真核表达载体pGL4质粒中,构建了六个重组表达载体pGL4-OVs,酶切鉴定及测序结果都表明本试验已成功构建了以上六种重组载体。3、鸡原代输卵管上皮细胞培养体系的建立通过培养条件优化,成功获得原代鸡输卵管上皮细胞,为检测卵清蛋白基因启动子的组织特异性表达提供了试验平台。4、卵清蛋白启动子片段的表达活性及特异性检测将六种启动子-报告基因重组载体转染至鸡输卵管上皮细胞、DF-1和鸡胚成纤维细胞,进行了萤光素酶活性的检测比较,找出具有最强活性、保存较好输卵管定位表达特异性的重组质粒pGL4-OV3;同时推断出若干包含增强子、抑制子、特异性调控元件的序列区域。推测-3102～-2042区中存在与组织特异性调控有关的抑制性调控元件,-1342～-921之间存在抑制性调控元件,-5436～-3102之间可能有抑制性区域；而在-2042～-1342区域中含有增强子元件,-6233-5436之间存在潜在的增强子序列。试验结果表明-921～+38区域不含有组织特异性元件。本研究为生物反应器转基因鸡的制备提供了优选启动子材料,也为家禽输卵管特异启动子的进一步优化提供了基础。

论文目录

  • 资助项目
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 缩略词
  • 第一章 家禽输卵管生物反应器的研究进展
  • 1 家禽输卵管生物反应器的概况及其优势
  • 1.1 乳腺生物反应器
  • 1.2 家禽输卵管生物反应器
  • 2 家禽生理学特征
  • 2.1 家禽的卵巢、输卵管和卵子形成
  • 2.2 家禽卵白蛋白质的形成和组成
  • 2.3 家禽的胚胎发育
  • 2.4 家禽胚胎的体外培养
  • 3 转基因家禽输卵管表达载体的构建
  • 3.1 输卵管上皮细胞的培养及体外基因转导
  • 3.2 卵清蛋白基因结构及表达调控
  • 4 转基因家禽研究方法
  • 4.1 显微注射法
  • 4.2 精子载体法
  • 4.3 反转录病毒法
  • 4.4 原始生殖细胞法
  • 5 转基因动物的检测
  • 5.1 PCR法检测
  • 5.2 Southern blot法检测
  • 5.3 染色体原位杂交（Chromosome in situ hybridization）法检测
  • 5.4 RNA水平检测
  • 5.5 翻译水平检测
  • 6 家禽输卵管生物反应器的存在问题及发展趋势
  • 7 本课题研究的目的和意义
  • 8 本试验的主要研究内容
  • 第二章 鸡卵清蛋白5调控序列OVs的克隆
  • 1 材料和方法
  • 1.1 试验动物
  • 1.2 菌种和质粒
  • 1.3 试验试剂和仪器
  • 1.4 试验方法
  • 2 结果分析
  • 2.1 PCR结果分析
  • 2.2 pMD19-T simple-OVs酶切鉴定结果
  • 3 讨论
  • 第三章 OVs启动子-萤光素酶报告基因载体构建
  • 1 材料和方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 试验方法
  • 2 结果分析
  • 2.1 pGL4-OV～OV4表达载体构建结果酶切鉴定
  • 2.2 pGL4-OV5、pGL4-OV6表达载体的构建结果酶切鉴定
  • 2.3 测序分析
  • 3 讨论
  • 第四章 鸡原代输卵管上皮细胞及对照细胞系的培养
  • 1 材料和方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 试验方法
  • 2 结果分析
  • 2.1 鸡原代输卵管上皮细胞培养
  • 2.2 鸡胚成纤维细胞培养
  • 2.3 DF-1细胞培养
  • 3 讨论
  • 第五章 几种重组报告基因载体表达活性测定
  • 1 材料和方法
  • 1.1 材料
  • 1.2 试验方法
  • 2 测定结果
  • 2.1 六种重组报告基因质粒在鸡原代输卵管上皮细胞中的表达活性检测
  • 2.2 六种重组报告基因质粒在DF-1细胞中的表达活性检测
  • 2.3 六种重组报告基因质粒在鸡胚胎成纤维细胞中的表达活性检测
  • 3 讨论
  • 全文结论
  • 创新点
  • 后续研究展望
  • 参考文献
  • 攻读学位期间发表的学术论文
  • 致谢

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