中国野生葡萄乙二醛氧化酶基因转化葡萄的研究

论文摘要

乙二醛氧化酶是参与植物抗病反应的一类酶,主要参与植物系统抗性的建立、促进植保素的合成。生产上栽培最为广泛的欧洲葡萄几乎均不抗病,而中国野生葡萄有着丰富的抗病基因资源。本研究旨在利用基因工程技术,将携带有中国野生葡萄乙二醛氧化酶基因的植物表达载体pWR306转入感病葡萄欧亚种“佳利酿”、华东葡萄“广西-2”的基因组中,为获得抗病性明显提高的转基因植株提供理论与技术依据。在以“佳利酿”、“广西-2”的花药为外植体进行体细胞胚诱导与成苗研究的基础上,初步建立了葡萄胚状体再生体系;并对次生胚的诱导、畸形苗的转化进行了初步研究。通过农杆菌介导法,将携带有中国野生葡萄乙二醛氧化酶基因的植物表达载体pWR306转入“广西-2”胚状体及胚性愈伤、合子胚胚性愈伤、“佳利酿”与“广西-2”的带芽茎段。取得的主要结果如下:1.以“佳利酿”、“广西-2”带芽茎段为材料,研究了不同培养基对外植体生长的影响,获得了适宜“佳利酿”、“广西-2”单芽茎段生长成苗的初代培养基WPM+IBA 0.15mg/L +琼脂6 g/L + AC 0.5 g/L;继代培养基1/2MS + IBA 0.15 mg/L +活性炭（AC）0.5 g/L +蔗糖30 g/L +琼脂6 g/L。2.培养基ER + 6-BA 1.0 mg/L + 2,4-D 1.0 mg/L + CH 1g/L + PVP 1 g/L +蔗糖30 g/L +琼脂6 g/L有利于“佳利酿”花药胚性愈伤组织诱导;所使用的培养基中,B5 + 6-BA 4.0 mg/L + 2,4-D 0.7 mg/L + CH 1 g/L + PVP 1 g/L +蔗糖30 g/L +琼脂6 g/L对“广西-2”花药的胚性愈伤组织诱导较为有利。3.“广西-2”的胚性愈伤为在B5 + 6-BA 4.0 mg/L + CH 1 g/L + PVP 1 g/L +蔗糖15 g/L的培养基上能形成胚状体;适宜胚状体萌发的培养基是不含生长调节剂的1/2B5 +蔗糖15 g/L液体培养基;而在液体的B5 + 6-BA 4.0 mg /L + 2,4-D 0.7 mg/L + CH 1 g/L + PVP 1 g/L +蔗糖15 g/L培养基中,胚状体能有效增殖;在MS + 6-BA 1.5 mg/L + IBA 0.2mg/L + CH 1 g/L + PVP 1 g/L +蔗糖15 g/L +琼脂6 g/L的培养基上畸形植株能被诱导形成正常苗;胚状体萌发成苗的适宜的培养基是WPM + IBA 0.15 mg/L + AC 0.5 g/L +蔗糖15 g/L +琼脂6 g/L;在对“广西-2”次生体胚诱导时,B5 + 6-BA 1.0 mg/L + 2,4-D 0.5 mg/L + CH 1 g/L + PVP 1 g/L +蔗糖30 g/L +琼脂6 g/L的培养基较为有效。4.以“广西-2”单芽茎段和胚状体为试材,潮霉素（Hyg）抗性浓度筛选结果表明,葡萄单芽茎段对Hyg致死浓度为12 mg/L,胚状体对Hyg致死浓度为9 mg/L。5.通过农杆菌介导法转化,已获得具有潮霉素抗性的“广西-2”胚性细胞团约23块,“佳利酿”抗性植株2个。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 葡萄遗传转化受体系统的研究进展
• 1.1.1 葡萄遗传转化的受体材料
• 1.1.2 葡萄器官发生途径的研究进展
• 1.1.3 葡萄体细胞胚发生途径的研究进展
• 1.1.4 影响葡萄再生的主要因素
• 1.2 葡萄遗传转化的研究进展
• 1.2.1 葡萄遗传转化途径
• 1.2.2 葡萄遗传转化中的存在问题
• 1.3 乙二醛氧化酶基因功能研究进展
• 1.3.1 乙二醛氧化酶基因研究进展
• 2O₂ 在植物抗病中的作用'>1.3.2 乙二醛氧化酶产物H₂O₂在植物抗病中的作用
• 1.4 本研究的目的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 目的基因及植物表达载体
• 2.2 试验试剂及主要仪器
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器设备
• 2.3 试验方法
• 2.3.1 葡萄再生体系的建立
• 2.3.2 农杆菌介导的遗传转化
• 2.3.3 外源基因的检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 葡萄遗传转化受体系统的建立
• 3.1.1 葡萄器官再生体系的建立
• 3.1.2 葡萄体细胞胚再生体系的建立
• 3.2 葡萄的遗传转化
• 3.2.1 抗生素敏感性试验
• 3.2.2 葡萄的遗传转化
• 3.2.3 外源基因的检测
• 第四章 讨论
• 4.1 关于器官发生影响因素的研究
• 4.2 关于葡萄胚状体诱导的研究
• 4.3 关于体细胞胚保存的研究
• 4.4 关于体细胞胚的萌发与畸形苗培养的研究
• 4.5 关于胚状体途径遗传转化的研究
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 缩略词
• 致谢
• 作者简介