rolC基因转化‘美人指’葡萄的研究

论文摘要

本研究以‘美人指’葡萄（Vitis vinifera L‘Manicure Finger’）为材料,建立培养方法简单的不定芽再生体系,并在此基础上采用农杆菌介导法和花粉管通道法,将rolC基因导入‘美人指’葡萄,以达到减缓‘美人指’葡萄的生长势、促进其花芽的形成的目的。研究结果如下:1.以‘美人指’葡萄叶片、叶柄和茎段为外植体,用不同浓度6-BA、TDZ与IBA组合在不同的基本培养基上诱导再生植株。结果表明:在MS、B5和NN693种基本培养基中,外植体均可直接再生不定芽,且再生率和出芽数差异不显著;6-BA与IBA组合中,MS+6-BA3.0 mg/L+IBA0.1 mg/L再生率最高,为6%;TDZ与IBA不同组合中,MS+TDZ 1.0 mg/L+IBA 0.2mg/L再生率最高,为4%。2.以‘美人指’葡萄离体叶片、叶柄和茎段为农杆菌介导转化rolC基因的受体,对农杆菌侵染时间、共培养时间、卡那霉素选择压及头孢霉素浓度等因素进行了研究。结果表明:农杆菌侵染4min,共培养3d,卡那霉素选择压3mg/L,头孢霉素浓度250mg/L为最佳的农杆菌介导法‘美人指’葡萄遗传转化体系。3.采用优化的农杆菌介导转化体系,对‘美人指’进行转化,共获得了12株抗性苗。利用GUS组织化学染色、PCR扩增及RT-PCR检测,结果表明,有2株抗性苗GUS染色呈阳性,其中有1株通过PCR和RT-PCR检测均扩增到540bp的条带,与rolC基因完全一致,证实rolC基因已经整合进入‘美人指’葡萄基因组中,并得到了表达。4.以‘美人指’葡萄花序为农杆菌介导转化rolC基因的受体,利用花粉管通道法对‘美人指’葡萄进行转化,共获得了40株后代单株。利用GUS组织化学染色、PCR及RT-PCR方法进行检测,结果表明,5株GUS染色呈阳性,GUS阳性率为12.5%;对其中的22株抗性株系进行PCR和RT-PCR检测,证实rolC基因已经整合进入2个株系的基因组中,并得到了表达。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1 rolC基因及其研究现状
• 1.1 Ri质粒与rol基因
• 1.2 rolC基因的功能与应用
• 2 葡萄基因转化的研究进展
• 2.1 转基因技术与常规育种手段的关系
• 2.2 葡萄基因转导途径
• 3 影响农杆菌介导葡萄基因转化的因素
• 3.1 农杆菌的侵染能力及载体的影响
• 3.2 农杆菌vir基因的活化
• 3.3 受体与再生系统
• 3.4 培养方法与培养条件
• 3.5 转化细胞的筛选和检测
• 4 展望
• 参考文献
• 第二章 离体诱导‘美人指'葡萄不定芽再生植株
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.3 调查项目
• 2 结果与分析
• 2.1 ‘美人指'葡萄不定芽的诱导
• 2.2 不同基本培养基对‘美人指'葡萄不定芽诱导的影响
• 2.3 不同浓度6-BA和IBA组合诱导‘美人指'外植体再生不定芽
• 2.4 不同浓度TDZ和IBA组合诱导‘美人指'外植体再生不定芽
• 2.5 不定芽的生长及生根
• 2.6 驯化及移栽
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 农杆菌介导的‘美人指'葡萄遗传转化体系的优化
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料来源
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 适宜农杆菌侵染时间的确定
• 2.2 适宜共培养时间的确定
• 2.3 适宜卡那霉素选择压的确定
• 2.4 适宜头孢霉素浓度的确定
• 3 讨论
• 参考文献
• 第四章 农杆菌介导rolC基因转化‘美人指'葡萄的获得与检测
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株、质粒和目的基因
• 1.3 GUS染色液配方（总10ml体系）
• 1.4 DNA提取所用溶液
• 1.5 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 转rolC基因‘美人指'葡萄植株的获得
• 2.2 GUS组织化学染色
• 2.3 PCR检测
• 2.4 RT-PCR检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 第五章 葡萄花粉管通道法转化rolC基因的研究
• 摘要
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果与分析
• 2.1 抗性苗的获得
• 2.2 抗性苗的GUS组织化学染色
• 2.3 抗性植株再生与非转基因植株再生检测
• 2.4 PCR扩增
• 2.5 RT-PCR检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 全文结论
• 图版
• 硕士在读期间发表的文章
• 致谢