草酸氧化酶基因转化杨树的研究

论文摘要

杨树（Populus spp.）是人工防护林的重要树种之一,在国民经济生产中起着其他树种所无法比拟的作用。一直以来,杨树因受病害威胁每年给国民经济造成的损失不可估量,而给生态环境造成的巨大破坏更是无法弥补的。利用基因工程技术对杨树进行抗病性遗传改良育种是切实可行的方法。草酸作为真菌分泌的毒素并参与致病,目前已在核盘菌属等10 个属中有报道。利用草酸降解酶的转基因植物来获得对分泌草酸病原真菌的抗性是一个极具前途的方法。而且,分解草酸所产生的H2O2 对病菌侵袭的早期反应,信号转导途径中调节过敏性坏死反应以及激活植物防御基因表达等抗病反应过程中都发挥着重要作用。本研究利用根癌土壤杆菌介导的叶盘法将来自小麦的草酸氧化酶基因（Oxalate oxidase, OxO）转入优良杨树树种,以获得对多种病原真菌有“广谱抗性”的转基因杨树。所用工程菌为LBA4404,双元植物表达载体为OxO-pGPTV-KAN,其上含有OxO基因gf2.8,卡那霉素（Kanamycin, Kan）抗性标记基因（新霉素磷酸转移酶（NPTII）基因,nptII）。选用抗逆性较强、广为种植的84K 杨（Populus alba ×Populus gllandulosa）和三倍体毛白杨（Populus tomentosa Carr.）作受体材料。具体研究内容如下: 1. 建立了84K 杨叶盘外植体高效再生系统。首次将2,4-D 同时用于杨树组织培养中的愈伤组织诱导和芽分化,筛选出最佳84K 杨叶盘外植体最佳不定芽诱导培养基配方为:MS + 0.02 mg/L 2,4-D + 1.0～1.5 mg/L 6-BA;叶盘诱导率高达90%～100%;每叶平均诱导芽数多达20 个左右。2. 通过腋芽分化获得三倍体毛白杨无菌苗,并建立了三倍体无菌苗的扩繁体系。筛选出适宜三倍体毛白杨叶盘不定芽分化的培养基为1/2 MS + 0.75 mg/L 6-BA + 0.01 mg/L NAA + 20 g/L蔗糖;叶盘诱导率为60%左右;每叶平均诱导芽数为3～4 个左右。3. 进行了84K 杨和三倍体毛白杨的卡那霉素敏感性测定。确定了84K 杨和三倍体毛白杨叶片芽诱导卡那霉素临界筛选浓度分别为20 mg/L和15 mg/L;并确定了两者芽生根卡那霉素临界筛选浓度分别为20 mg/L 和15 mg/L。4. 摸索了根癌土壤杆菌介导的叶盘法转化杨树的各种影响因素。基本确定适宜的转化路线为:诱导培养基上叶盘预培养2～3 d →　OD600 约为0.5 稀释的菌液中侵染5～10 min →　诱导培养基上共培养4～5 d（暗培养） →　脱菌处理10　d 左右（诱导培养基附加适量浓度的头孢霉素或羧苄青霉素）　→　选择性生根培养基(生根培养基附加适量浓

论文目录

• 第一章 文献综述
• 1.1 杨树遗传改良基因工程研究进展
• 1.1.1 抗除草剂基因工程
• 1.1.2 抗虫基因工程
• 1.1.3 抗病基因工程
• 1.1.4 抗逆基因工程
• 1.1.4.1 抗盐、抗旱、抗冻等转基因研究
• 1.1.4.2 抗氧化转基因研究
• 1.1.5 其他转基因研究
• 1.1.5.1 材性改良转基因研究
• 1.1.5.2 生殖发育转基因研究
• 1.1.6 存在的问题与展望
• 1.1.6.1 遗传转化频率低
• 1.1.6.2 目的基因导入后的问题
• 1.1.6.3 基因来源贫乏
• 1.1.6.4 转基因杨树的生态风险
• 1.3 植物抗病过程中活性氧的作用
• 1.3.1 直接抗菌活性
• 1.3.2 参与细胞壁的固化
• 1.3.3 诱导植保保卫素的合成
• 1.3.4 作为信号转导物质参与系统获得抗病性的建立
• 1.3.5 诱导受侵细胞发生敏性坏死反应
• 1.4 病原菌草酸毒素的致病性
• 1.4.1 病原菌侵染过程中草酸与酶的协同作用
• 1.4.2 草酸与病原菌的致病性、毒性的关系
• 1.5 Germin 与草酸氧化酶
• 1.6 本研究的目的意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌种和质粒
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 试剂及引物
• 2.1.5 仪器及设备
• 2.1.6 溶液配制
• 2.2 研究方法
• 2.2.1 菌种的保存与活化
• 2.2.2 无菌苗的获得及繁殖
• 2.2.3 叶盘再生系统的建立
• 2.2.3.1 84K 杨叶片再生系统的建立
• 2.2.3.2 三倍体毛白杨叶片再生系统的建立
• 2.2.4 抗生素敏感性试验
• 2.2.4.1 卡那霉素敏感性试验
• 2.2.4.2 抑菌用抗生素的选择
• 2.2.5 根癌土壤杆菌敏感性试验
• 2.2.6 根癌土壤杆菌介导的遗传转化
• 2.2.6.1 工程菌悬液的制备
• 2.2.6.2 叶盘法转化杨树
• 2.2.6.3 抗卡那霉素再生苗的获得
• 2.2.6.4 影响根癌土壤杆菌转化效果的因素
• 2.2.7 再生苗的分子检测
• 2.2.7.1 杨树基因组DNA 的提取方法
• 2.2.7.2 细菌质粒的提取
• 2.2.7.3 再生苗的PCR 检测
• 第三章 结果与分析
• 3.1 84K 杨基因转化受体系统的建立
• 3.1.1 叶盘的再生
• 3.1.2 卡那霉素敏感性试验结果
• 3.1.2.1 芽诱导卡那霉素敏感性试验
• 3.1.2.2 芽生根卡那霉素敏感性试验
• 3.2 三倍体毛白杨基因转化受体系统的建立
• 3.2.1 叶盘的再生
• 3.2.2 卡那霉素敏感性试验
• 3.2.2.1 芽诱导卡那霉素敏感性试验
• 3.2.2.2 芽生根卡那霉素敏感性试验
• 3.3 影响根癌土壤杆菌转化效果的因素
• 3.3.1 菌液浓度
• 3.3.2 侵染时间
• 3.3.3 预培养时间
• 3.3.4 共培养时间
• 3.3.5 推迟筛选
• 3.4 抗卡那霉素再生苗的获得及其分子检测
• 第四章 讨论
• 4.1 再生系统的建立
• 4.2 影响转化成败的关键因素分析
• 结论
• 致谢
• 参考文献