苏云金芽胞杆菌对家蚕杀虫活性中肠道菌MB1的增效作用

论文摘要

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)是一种可以伴随芽胞形成而产生伴胞晶体的革兰氏阳性菌。相关学者对Bt杀虫活力的提高做了大量的研究,并取得了系列进展,同时对Bt杀虫机制的研究也提出了不同的作用模型,如饥饿模型与败血症模型。近年来,研究者提出了肠道菌对Bt的杀虫活性具有重要影响的假说：即肠道菌对Bt杀虫活性具有增效作用或抑制作用,但肠道菌对Bt杀虫活性的影响没有形成一致的认识,其作用机理更不明确。本文利用所分离的家蚕(Bombyx mori)肠道菌系统比较了其对Bt杀虫活性的影响,发现一株对Bt杀虫活性具有增效作用的肠道菌MB1,且对MB1的增效作用机制进行了初步的研究,旨在阐明肠道菌MB1对Bt杀虫活性的增效作用及其作用机制。1.通过对蚕卵体表消毒的方法建立了未接触抗生素的无菌家蚕,为准确获取肠道菌对Bt杀虫活性的影响以及后续研究提供材料。2.通过生物测定,获得对Bt杀虫活性具有增效作用的肠道菌MB 1。通过对两种不同处理无菌家蚕的研究,发现抗生素对Cry蛋白杀虫活性存在显著影响,在家蚕的终死亡率与死亡速度上,抗生素显著降低家蚕对Cry蛋白的敏感性。此外,肠道菌MB1和Bt芽胞对Cry蛋白杀虫活性具有良好的协同作用,而芽胞本身对家蚕无任何影响,具体作用机制尚不清楚。3.我们进行了肠道菌MB1对Bt杀虫活性增效作用机制的研究,首先通过家蚕肠道菌定殖实验发现肠道菌MB1的增效作用并不是由于定殖数量优势而起作用,而可能与其菌株自身特性相关；通过比较肠道菌MB1对Cry原毒素和Cry活化蛋白杀虫活性的影响,结果发现,肠道菌MB1对Cry活化蛋白杀虫活性无显著影响,而对Cry原毒素杀虫活性具有显著的影响,这说明肠道菌MB1在Cry原毒素激活过程中可能起到一定的增效作用。4.对肠道菌MB1和BMB171在家蚕血淋巴液中生长情况进行检测,结果发现肠道菌MB1和BMB171都能在家蚕血淋巴液中生长,这可能与MB1的增效作用以及Bt属于昆虫病原菌的属性相关。5.本研究将肠道菌MB1和BMB171菌体注入家蚕血淋巴腔中观察其死亡情况,结果发现,向家蚕血淋巴腔中注入BMB171较肠道菌MB1更容易引起家蚕的死亡,且家蚕的死亡率与菌体数量具有正相关性。综上,肠道菌MB1对Bt杀虫活性的增效作用可能与其能够在血淋巴液中生长,且达到一定数量进而导致家蚕死亡有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语
• 1 前言
• 1.1 苏云金芽胞杆菌简介
• 1.2 苏云金芽胞杆菌的分类
• 1.3 苏云金芽胞杆菌Cry蛋白
• 1.3.1 Cry蛋白及其多样性
• 1.3.2 Cry蛋白的结构
• 1.4 苏云金芽胞杆菌的杀虫机制
• 1.4.1 Cry蛋白的受体
• 1.4.2 Cry蛋白的作用机制
• 1.5 苏云金芽胞杆菌的增效途径
• 1.5.1 苏云金芽胞杆菌的增效物质
• 1.5.1.1 丝氨酸蛋白酶抑制剂
• 1.5.1.2 几丁质酶
• 1.5.1.3 Cyt蛋白
• 1.5.1.4 营养期杀虫蛋白
• 1.5.1.5 钙黏蛋白受体肽CR12-MPED
• 1.5.1.6 辅助蛋白P19、P20、P21
• 1.5.2 cry基因的修饰改造
• 1.5.2.1 定点突变
• 1.5.2.2 Cry蛋白杂交
• 1.5.2.3 引入特异的蛋白酶酶切位点
• 1.5.2.4 去除Cry蛋白的部分小区域
• 1.6 昆虫肠道共生菌
• 1.6.1 昆虫肠道共生菌对昆虫的作用
• 1.6.2 昆虫肠道共生菌对Bt杀虫活性的影响
• 1.6.2.1 昆虫肠道共生菌对Bt杀虫活性的增效作用
• 1.6.2.2 昆虫肠道共生菌对Bt杀虫活性的抑制作用
• 1.7 研究目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株
• 2.1.2 PCR引物
• 2.1.3 培养基及人工饲料
• 2.1.4 抗生素及其工作浓度
• 2.1.5 供试昆虫
• 2.1.6 试剂
• 2.1.7 仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 家蚕幼虫的饲养
• 2.2.2 无菌家蚕品系的建立
• 2.2.2.1 家蚕的抗生素饲喂
• 2.2.2.2 蚕卵体表消毒
• 2.2.3 无菌家蚕肠道微生物的检测
• 2.2.3.1 可培养方法检测
• 2.2.3.2 不可培养方法检测
• 2.2.4 对Bt杀虫活性具有增效作用的家蚕肠道菌的筛选
• 2.2.4.1 Cry原毒素的制备
• 2.2.4.2 Cry活化蛋白的制备
• 2.2.4.3 Cry蛋白的浓度测定
• 2.2.4.4 Cry蛋白的SDS-PAGE检测
• 2.2.4.5 对Bt杀虫活性具有增效作用的肠道菌筛选
• 2.2.5 肠道菌MB1和Bt芽胞对Cry蛋白协同作用的测定
• 2.2.6 肠道菌MB1对Bt杀虫活性增效作用机制
• 2.2.6.1 肠道菌在家蚕体内的定殖
• 2.2.6.2 肠道菌MB1对Cry活化蛋白杀虫活性影响的生物测定
• 2.2.6.3 血淋巴液中肠道菌MB1和BMB171的体外增殖
• 2.2.6.4 注射肠道菌MB1和BMB171对家蚕的影响
• 3 结果与讨论
• 3.1 无菌家蚕品系的建立
• 3.2 对Cry蛋白杀虫活性具有增效作用的肠道菌筛选
• 3.2.1 Cry蛋白样品的测定
• 3.2.2 肠道菌对Cry蛋白杀虫活性的影响
• 3.2.3 抗生素对Cry蛋白杀虫活性的影响
• 3.2.4 肠道菌对Bt胞晶混合物杀虫活性的影响
• 3.2.5 肠道菌MB1和Bt芽胞对Cry蛋白杀虫活性的协同作用
• 3.3 肠道菌MB1对Bt杀虫活性增效作用机制
• 3.3.1 肠道菌在家蚕体内的定殖
• 3.3.2 肠道菌MB1对Cry活化蛋白杀虫活性的影响
• 3.3.3 血淋巴液中肠道菌MB1和BMB171的体外增殖
• 3.3.4 注射肠道菌MB1和BMB171对家蚕的影响
• 3.4 讨论
• 参考文献
• 致谢