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金丝猴胰岛素样生长因子Ⅰ克隆、表达及其序列分析

2020-11-22阅读(399)

金丝猴胰岛素样生长因子Ⅰ克隆、表达及其序列分析

论文摘要

野生动物是自然生态环境的重要组成部分,保护野生动物尤其是拯救濒危野生动物,对维持地球生态平衡和保持生物多样性具有重要意义。圈养人工繁殖,是移地保护濒危动物,增加动物种群数量的重要手段之一。但在圈养条件下,多数濒危动物繁殖率都较低,严重阻碍移地保护的进程。因此,本研究针对濒危动物繁殖率低的金丝猴,开展了在动物生长发育和生殖过程中发挥重要作用的胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）的基因克隆、序列分析和表达研究,并探讨了今后生物工程生产金丝猴等濒危动物胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）用于人工繁殖实践的意义和可能性。主要结果如下: 1.利用RT-PCR技术从肝脏组织扩增出金丝猴胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）编码区序列,克隆和分析了进化上较保守,并在生长发育、生殖和免疫调节中发挥重要作用的金丝猴IGF-Ⅰ基因。结果显示,它编码153个氨基酸的前体蛋白质,预测的分子量分别为16.9kD。AmIGF cDNA编码48氨基酸的信号肽和70氨基酸的成熟肽。 2.与GenBank中人、猪、鼠、马、牛、兔、山羊哺乳动物的IGF-Ⅰ序列比较,其编码成熟肽序列的同源性从93.8%（马）到88.6%（鼠）,开放框序列的同源性从94.4%（人）到88.5%（鼠）。 3.构建金丝猴IGF-Ⅰ基因的原核表达载体pET-IGF-Ⅰ,IPTG诱导后在BL21宿主菌中得到高效融合表达,表达的融合蛋白DsbA-IGF-Ⅰ的分子量约为32kD,并以可溶形式存在于细胞中。为进一步的研究打下了基础。 4.IGF-Ⅰ在畜牧业生产中被广泛用于促生长发育和促繁育,目前已在猪、牛、羊等动物中得到试用,但是效果普遍较差,其原因不甚清楚。本试验比较了克隆的金丝猴与人、猪、鼠、马、牛、兔、山羊哺乳动物相应序列,发现金丝猴序列与人的序列具有最高的同源性,提示人IGF-Ⅰ可能是金丝猴人工繁殖研究应用中外源性异种激素的

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 前言
  • 1. 实验材料
  • 1.1 材料和试剂
  • 1.1.1 材料
  • 1.1.2 主要试剂与酶类
  • 1.1.3 菌株和质粒
  • 1.1.4 常用缓冲溶液和培养基的配制
  • 1.1.5 主要仪器设备
  • 1.1.6 使用的主要生物信息数据库和计算机软件
  • 2. 实验方法
  • 2.1 肝组织处理
  • 2.2 总RNA的提取
  • 2.3 金丝猴 IGF-I开读框序列的克隆
  • 2.3.1 PCR引物的设计
  • 2.3.2 RT-PCR
  • 2.3.2.1 第一链cDNA的合成
  • 2.3.2.2 PCR反应
  • 2.3.3 PCR产物的克隆
  • 2.3.3.1 JM109高效感受态制备
  • 2.3.3.2 PCR产物的回收
  • 2.3.3.3 PCR产物和pGEM-T Easy载体的连接
  • 2.3.3.4 连接产物的转化
  • 2.3.4 重组质粒的PCR鉴定
  • 2.3.5 重组子的序列测定
  • 2.3.6 计算机序列分析
  • 2.3.7 克隆序列的GenBank登录
  • 2.4 IGF-I基因在大肠杆菌中的表达
  • 2.4.1 原核表达载体的构建
  • 2.4.1.1 引物设计
  • 2.4.1.2 TOP10F与BL21（DE3） PlSs感受态细胞的制备
  • 2.4.1.3 重组质粒pGEM-IGF-I的提取
  • 2.4.1.4 pET-DsbA质粒的大量提取及纯化
  • 2.4.2 金丝猴 IGF-I基因原核表达载体的构建
  • 2.4.3 金丝猴 IGF-I基因在 BL21中的诱导表达
  • 2.4.3.1 融合蛋白的表达和样品的制备
  • 2.4.3.2 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳分析
  • 2.4.4 表达蛋白的可溶性分析
  • 3 结果
  • 3.1 总RNA的分离
  • 3.2 金丝猴IGF-I编码区序列的克隆
  • 3.2.1 PCR鉴定
  • 3.2.2 测序分析
  • 3.2.3 同源性比较分析
  • 3.3 IGF-I基因在大肠杆菌中的表达
  • 3.3.1 原核表达载体pET-IGF-I的鉴定
  • 3.3.2 表达产物的电泳分析
  • 4 讨论
  • 5 展望
  • 参考文献
  • 文献综述
  • 综述 胰岛素样生长因子I（IGF-I）的研究进展
  • 1. 概述
  • 2 IGF-I的性质与特点
  • 3 IGF-I的生理功能
  • 3.1 IGF-I与生长发育
  • 3.2 IGF-1与代谢作用
  • 3.2.1 IGF-1与蛋白代谢
  • 3.2.2 IGF-1与脂代谢
  • 3.3 IGF-1的免疫调节作用
  • 3.3.1 调节Tc的生长、分化和效应完成
  • 3.3.2 促进淋巴组织增生
  • 3.3.3 刺激淋巴细胞的趋化
  • 3.4 IGF-1与细胞凋亡
  • 3.5 IGF-1与中枢神经系统
  • 4 IGF-1在实际中的应用
  • 4.1 IGF-1的免反调节作用在自身免疫性糖尿病中的应用
  • 4.2 胰岛素对I型糖尿病的预治作用
  • 4.3 IGF-1在中枢神经系统损伤中的应用
  • 4.4 IGF-1对GH不敏感所致矮小症的治疗
  • 4.5 IGF-1对急性肾损伤和慢性肾脏疾病的作用
  • 5 IGF-1应用的潜在危险
  • 参考文献
  • 致谢
  • 在读期间科研成果简介
  • 声明

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