青贮饲料中产纤维素酶细菌的筛选、发酵和产酶条件优化及酶学性质初探

论文摘要

本研究分离筛选了一株产纤维素酶的芽抱杆菌ws-6,优化了该菌株的产酶发酵条件,初步研究了酶学性质,并进一步优化了菌株的发酵条件,结果分述如下:菌株分离筛选及鉴定从乌苏窖藏饲料中分离筛选出6个产CMCase的菌株,以代号ws-6的菌株产酶水平最高,通过形态学、生理生化指标及16S rDNA序列比对,鉴定为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。菌株最适生长pH值为5.0～7.0,最适生长温度35℃,产CMCase活力达2.55U/mL。菌株产酶条件及酶学性质经碳、氮源及微量元素的筛选实验和正交实验分析,最适合菌株ws-6产CMCase的发酵培养基组成为（g/L）:葡萄糖15g、CMC-Na 5g、酵母膏15g、KH2PO40.5g、NaCl 5g。发酵产酶的最适初始pH值为6.5,最适培养温度为35℃,最适装液量30mL（250mL三角瓶）。对菌株ws-6的酶学性质进行初步研究表明:酶反应的最适pH值为5.0,最适温度为50℃,最适底物浓度为0.6%,最适反应时间为20min。菌株发酵条件优化经碳、氮源及微量元素的筛选实验和正交实验分析,确定ws-6菌株发酵培养基的最佳组分为（g/L）:蔗糖60g、蛋白胨30g、NaCl 30g、K2HPO4 2 g、MgSO4 1 g、FeSO4 0.02 g、MnSO4 0.01 g。对发酵条件进行了研究,发酵的最适初始pH值为5.5,最适培养温度为35℃,最适装液量为10mL（250mL三角瓶）,通过优化培养基组分和培养条件后,菌株ws-6活菌数达到了6.58×1010CFU·mL-1。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 青贮饲料的研究概况
• 1.2.1 青贮原料的特点
• 1.2.2 青贮饲料及其微生物组成
• 1.2.3 青贮发酵过程
• 1.2.4 青贮类型
• 1.3 纤维素酶的研究进展
• 1.3.1 纤维素酶系组成及催化机制
• 1.3.2 纤维素酶在青贮饲料中的作用
• 1.3.3 国内外添加纤维素酶青贮的研究进展
• 1.3.4 纤维素酶的来源
• 1.3.5 纤维素酶在开发饲料资源方面的应用
• 1.3.6 饲料纤维素酶活力检测的方法与标准
• 1.4 展望
• 第二章 青贮饲料中产纤维素酶细菌的筛选、分离纯化及鉴定
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 材料
• 2.2.1.1 实验材料
• 2.2.1.2 试剂
• 2.2.1.3 仪器
• 2.2.1.4 培养基
• 2.2.2 方法
• 2.2.2.1 初筛
• 2.2.2.2 刚果红染色鉴定法
• 2.2.2.3 摇瓶复筛
• 2.2.2.4 羧甲基纤维素酶（CMCase）活力测定
• 2.2.2.5 菌种鉴定方法
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 菌株的筛选
• 2.3.2 ws-6 菌株产纤维素酶能力的验证
• 2.3.3 菌株的鉴定
• 2.3.3.1 菌株的形态观察
• 2.3.3.2 菌株的生理生化鉴定
• 2.3.3.3 菌株的分子鉴定
• 2.4 讨论
• 第三章 ws-6 菌株产酶条件优化及酶学性质初探
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.1.1 实验材料
• 3.2.1.2 试剂
• 3.2.1.3 仪器
• 3.2.1.4 培养基
• 3.2.2 方法
• 3.2.2.1 菌种活化
• 3.2.2.2 种子液的制备
• 3.2.2.3 摇瓶培养
• 3.2.2.4 酶液制备
• 3.2.2.5 生物量测定
• 3.2.2.6 羧甲基纤维素酶（CMCase）活力测定
• 3.2.2.7 ws-6 菌株发酵产酶培养基组分筛选
• 3.2.2.8 ws-6 菌株的产酶条件优化
• 3.2.2.9 ws-6 菌株生长曲线和酶活曲线的测定
• 3.2.2.10 ws-6 菌株产CMCase 酶学性质的初步测定
• 3.3 结果和分析
• 3.3.1 ws-6 菌株发酵产酶培养基组分筛选
• 3.3.1.1 不同碳、氮源对产酶的影响
• 3.3.1.2 微量元素对产酶的影响
• 3.3.1.3 产酶培养基配方正交优化实验设计
• 3.3.2 ws-6 菌株产酶条件优化
• 3.3.2.1 初始pH 和培养温度对产酶的影响
• 3.3.2.2 装液量对产酶的影响
• 3.3.3 ws-6 菌株生长曲线和酶活曲线
• 3.3.4 ws-6 菌株产CMCase 酶学性质的初步测定
• 3.3.4.1 酶反应的最适pH 值
• 3.3.4.2 底物浓度对酶活的影响
• 3.3.4.3 酶反应的最适温度
• 3.3.4.4 酶反应的最适反应时间
• 3.4 讨论
• 第四章ws-6 菌株发酵培养基及发酵条件优化
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.1.1 实验材料
• 4.2.1.2 试剂
• 3.2.1.3 仪器
• 4.2.1.4 培养基
• 4.2.2 方法
• 4.2.2.1 菌种活化
• 4.2.2.2 种子液的制备
• 4.2.2.3 摇瓶培养
• 4.2.2.4 培养基的单因素实验
• 4.2.2.5 正交实验设计
• 4.2.2.6 生长曲线的测定
• 4.2.2.7 发酵条件的优化
• 4.2.2.8 测定方法
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 发酵培养基优化
• 4.3.1.1 碳源
• 4.3.1.2 氮源
• 4.3.1.3 无机盐
• 4.3.1.4 碳源、氮源和无机盐的正交优化
• 4.3.2 生长曲线的测定
• 4.3.3 发酵条件优化
• 4.3.3.1 初始 pH 值
• 4.3.3.2 温度
• 4.3.3.3 装液量
• 4.3.3.4 接种量
• 4.4 讨论
• 第五章 本论文的主要成果及后续研究设想
• 5.1 本论文的主要研究成果
• 5.2 后续研究展望
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 导师评阅表