猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州株的分离鉴定及ORF5基因真核表达质粒的构建

论文摘要

本研究通过对贵州省某县猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征病料（包括肝、肺、肾、淋巴结、心、脾组织）进行病毒分离鉴定。通过在Marc-145细胞上培养传代后,细胞出现了以变圆、聚集成堆、并呈灶状脱落为特征细胞病变（CPE）,而该病料接种Vero、PK15和BHK21细胞盲传5代均不出现典型的细胞病变。通过特异性的抗血清中和试验和PCR鉴定比较,证明该病毒为PRRSV病毒,并将其命名为PRRSV Guizhou-1株。通过电镜检测发现了直径为40～60nm的病毒粒子。理化试验表明:该病毒在56℃30min能被灭活,对酸、酶、氯仿敏感,在PH3.0时病毒毒力丧失,经酶和氯仿处理后病毒失活。测得该毒株的TCID50为10-7.5/0.1mL,通过对该病毒动物模型的复制和基因序列的比较,发现该病毒为高致病性猪蓝耳病病毒,与湖南（Hunan-3）株的同源性为100%。参考GenBank上PRRSV LV、VR-2332毒株核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,提取疑似病料（包括肝、肺、肾、淋巴结、心、脾组织）的总RNA为模版,应用RT-PCR方法,经94℃预变性2min;94℃变性45s,60℃退火1min,72℃延伸1min进行35个循环;72℃再延伸10min进行扩增。扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明:所扩增的目的DNA条带大小约750bp,与预期大小相似。扩增产物经回收纯化后,应用pMD18—T载体进行克隆后测序。测序结果表明,所扩增大小为739bp,ORF5基因全长为603bp,编码200个氨基酸,将该核苷酸序列与其他分离株进行同源性比较,结果与美洲参考株VR-2332的核酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别为89.4%和88.1%;与疫苗株MLV的核酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别为89.0%和87.5%;与国内代表株CH-1a的核酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别为95.5%和93.0%;与湖南Hunan-1PRRSV序列同源性为100%;但与欧洲参考毒株LV的核酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别为29.2%和6.0%。这在分子水平上确定了Guizhou-1在基因型上与美洲型毒株更为接近,与欧洲型毒株相差较远。进一步证实了贵州地区存在美洲型PRRSV流行。选用pcDNA3.1（+）真核表达载体和合适的酶切位点,设计一对特异性引物,将PRRSVGuizhou-1株的ORF5基因插入其中,构建了pcDNA-PRRSV-Guizhou-1-ORF5真核表达质粒,通过酶切和PCR鉴定证明质粒构建成功,为猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸疫苗的研制奠定了的基础。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 第一章 猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州株的分离与鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 实验方法
• 2 实验结果
• 2.1 临床诊断结果
• 2.2 金标检测卡诊断结果
• 2.3 病理诊断结果
• 2.4 病例模型复制结果
• 2.5 RT-PCR产物扩增结果
• 2.7 病毒形态透射电镜观察
• 2.8 病毒间接免疫荧光鉴定
• 50)'>2.9 病毒感染力的滴定(TCID₅₀)
• 2.10 分离病毒理化特性的鉴定结果
• 2.11 病毒中和试验
• 3 讨论
• 4 小结
• 第二章 猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州株ORF5的克隆及序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 实验方法
• 2 实验结果
• 2.1 酶切结果
• 2.2 ORF5基因的核苷酸组成及推导的氨基酸序列结果
• 2.3 与不同毒株ORF5核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性比较分析
• 2.4 PRRSV Guizhou-1株ORF5基因氨基酸亲水性、抗原位点及表面极性分析
• 2.5 PRRSV基因遗传进化树分析
• 3 讨论
• 4 小结
• 第三章 PRRSV-ORF5基因真核表达质粒的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 第四章 猪繁殖与呼吸综合征的研究进展
• 参考文献
• 本人在校读研期间所发表的论文
• 致谢
• 附录:主要试剂和溶液的配制